细胞流式仪检测细胞因子

xuexi-ing

流式细胞因子的检测相关问题
      老师们好：最近用流式细胞仪检测脾脏组织和肿瘤组织单细胞的TNF-α和IFN-γ细胞因子表达的实验，用PMA、离子霉素刺激，BFA进行阻断，细胞培养箱培养4-6h，检测的流式结果图很奇怪，主要有（1）mCD45会拉很长；（2）mCD3不分群，只要在细胞间培养就会有这种现象（包括不进行刺激的）；
请问大家这是为什么呢？有没有做过此类实验的呢？

niwanmao

你前面在其它回帖里面重复过这个问题了。
两个可能性：
1、之前细胞活力就不好。
2、刺激时间过长或刺激剂浓度过大，导致细胞活力差。

xuexi-ing

niwanmao 发表于 2019-12-19 20:18
你前面在其它回帖里面重复过这个问题了。
两个可能性：
1、之前细胞活力就不好。

倪老师，我刺激的话就是4-6hr，方法一用的是eBi的那个细胞刺激试剂盒，方法二就是自己单独加20ng/mL的PMA，1μM Ionomycin和2μM BFA进行刺激阻断，但是两种检测出来都是mCD3分群不好，就是相同样品的细胞不进行培养箱培养刺激就会分群，请问这可能会是由于培养造成这种现象吗？

xuexi-ing

niwanmao 发表于 2019-12-19 20:18
你前面在其它回帖里面重复过这个问题了。
两个可能性：
1、之前细胞活力就不好。

老师，我还有一个问题就是最近需要检测一下肿瘤组织里边的IFN-γ等细胞因子，请问您这边关于肿瘤单细胞制备后的处理以及铺板刺激的细胞密度有好的建议吗？因为我做了一次感觉如果铺2E6的话TILs就比较少，在经过刺激细胞就更少了，但是如果铺的多了，细胞就基本不贴壁，有很多肿瘤细胞，在刺激培养后就会有很多死细胞，检测的结果很难分析，您这边有没有比较好的建议或者是方法呢？

niwanmao

xuexi-ing 发表于 2019-12-20 09:18
倪老师，我刺激的话就是4-6hr，方法一用的是eBi的那个细胞刺激试剂盒，方法二就是自己单独加20ng/mL的PMA ...

我们做过不少PMA和Ion刺激的，都没出现CD3降低。所以我觉得只能从细胞活力上找原因了，是否你那边的细胞刺激后易死亡？
另一个问题也同样还是需要在细胞活力上找原因。