关于流式检测Th1细胞的几个问题的集中讨论,

cellprobe

打算用CD3+CD28磁珠刺激PBMC，用无血清培养基+500 u/ml IL-2+ 50 u/ml IL-15培养三天以后，检测Th1, Th17, Treg细胞的比例。
以检测Th1和Th17细胞为例，抗体染色方法如下：
使用FITC-CD4,   PE-IL-17A，PE/Cy5-IFN-r三种抗体，和相对应的三种isotype对照抗体。
1. unstained control;
2. FITC染色对照；
3. PE染色对照；
4. PE/Cy5染色对照；
5. 三种抗体共同染色的实验组；
6. 三种isotype对照抗体同时染色的对照组（用于设门的）


问题
1. PBMC刺激三天以后，CD4比例明显降低，用抗体圈CD4阳性细胞好，还是圈CD3+CD8-细胞好？
2. 可以先固定和破膜，同时染细胞内和细胞外的抗体吗？还是必须先染细胞外抗体，然后固定和破膜，再染细胞内的抗体？
3. 把三种同型对照抗体同时染细胞，作为寻找阳性和阴性的boundary，用于画十字门，这种方法有问题吗？

niwanmao

1、关于CD4下调的染色解决方法，以前讲过很多次，在此再转一次：
目前用于改善CD4 +细胞检测的方法包括：
（1）选择CD4抗体克隆，其可以在固定/破膜之后与细胞内抗体一起添加，做胞内CD4（Kemp, Bruunsgaard，2001）。
（2）利用替代标志物，如CD3 +（Eastaff-Leung等，2010）或CD3 + CD8-（Kallas等，1999）（流式中文网注：这个不是特别建议，前者用总T来表示，后者只适用那些CD4－CD8－亚群少的样本）
（3）用其他刺激方法，例如SEB，但只有5～20％的T细胞会对SEB有反应（Roederer 等，2004），所以也不通用。
（4）用CD4 BV421，可能会更好的检测到CD4信号，另外，推荐同时用CD8，使得圈出的CD4＋T细胞更纯。


2、如果抗原胞内和胞外都有，这样染就有问题，而且这样做，对于一些固定之后构象发生改变的抗原，也容易染不上。因此，建议按照先表面，再固定破膜。

3、设门，还是强调了很多次，不要用同型对照、不要用同型对照、不要用同型对照。而是FcBlocking之后的FMO对照。

cellprobe

niwanmao 发表于 2019-12-20 15:13
1、关于CD4下调的染色解决方法，以前讲过很多次，在此再转一次：
目前用于改善CD4 +细胞检测的方法包括：
...

尊敬的倪老师：
1. （1）的意思是检测细胞内的CD4吗，不做细胞外的CD4？（4）BV421是检测细胞内的还是检测细胞外的CD4？ 您觉得是检测细胞外CD4好还是检测细胞内CD4好？
2.  既然固定和破膜对细胞外CD4染色有影响，那么我就先染色CD4，然后洗细胞，再固定和破膜，染色细胞内因子。
3. 检测Th1和Th17等也需要Fc blocking吗？我不做Fc blocking，也能检测到Th1细胞啊。Fc blocking是必须做的吗？市场上哪家Fc blocking试剂比较好？

我从BD的间充质干细胞标志物检测试剂盒上看到就是用不同isotype的混合物做对照，这个不好吗？请问FMO怎么做呢？
非常感谢！

cellprobe

文章上传了：结论是PMA刺激细胞后，可以直接细胞内染色；那么怎么鉴定什么样的CD4抗体克隆可以细胞内染色呢？
谢谢。

niwanmao

cellprobe 发表于 2019-12-20 15:51
尊敬的倪老师：
1. （1）的意思是检测细胞内的CD4吗，不做细胞外的CD4？（4）BV421是检测细胞内的还是检 ...

1、严格来说，不是检测胞内CD4，我前面的表述不算特别准确，CD4永远是胞膜的。而是因为CD4由于内吞，直接染可能由于空间位阻会很难染上或即使染上分子数量也偏少，所以通过破膜的方法，使其能够被充分染上。 而BV421的CD4能够染上，与其荧光分子的大小以及强度有关，是文献提示的，我没试过。
2、固定和破膜，对胞膜CD4没影响，我说的是对某些功能性分子可能会有影响，需要对比过。
3、Fc Blocking推荐做。各家都差不多。

cellprobe

niwanmao 发表于 2019-12-21 10:43
1、严格来说，不是检测胞内CD4，我前面的表述不算特别准确，CD4永远是胞膜的。而是因为CD4由于内吞，直接 ...

倪老师，PDF第二页黄色标记的 Cells 2 isotypes是什么组合吗？目的是什么？谢谢！
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTk0NDh8ODgyNjQxNzV8MTczNjM1Nzc2OHwwfA%3D%3D

niwanmao

cellprobe 发表于 2019-12-22 23:35
倪老师，PDF第二页黄色标记的 Cells 2 isotypes是什么组合吗？目的是什么？谢谢！

同型对照还是想设门，但是同型对照的理念还是过时了。

cellprobe

niwanmao 发表于 2019-12-23 11:32
同型对照还是想设门，但是同型对照的理念还是过时了。

Cells 2 isotypes，这一组是多余的是吗？

cellprobe

niwanmao 发表于 2019-12-23 11:32
同型对照还是想设门，但是同型对照的理念还是过时了。

是不是单染的话，需要同型对照抗体；多色染色需要FMO对照？

niwanmao

cellprobe 发表于 2019-12-23 14:46
是不是单染的话，需要同型对照抗体；多色染色需要FMO对照？

单染也不建议同型，而是实验管和对照管均用Fc Block之后，实验管染抗体，对照管不染即可。此时的本底，已经基本干净了。