分离细胞外囊泡，什么方法最好？

niwanmao

从生物体液中分离尽可能纯的细胞外囊泡（EV）至关重要，因为可溶性蛋白和脂蛋白的共分离可能会阻碍对实验结果的解释。例如基因组、蛋白质组学和脂质组学研究要求EV尽可能纯净，以确保所测量的是与EV相关的成分，而不是干扰杂质。无论要从哪种类型的生物样本中分离以及使用哪种分离方法，了解EV的特性，例如粒径分布、颗粒浓度、纯度和表型，对于确保下游分析的灵敏度和准确性十分重要。与血清相比，血浆通常是首选的EV来源，因为在制备血清时血凝块形成过程中血小板会释放出更多的EV。

厦门大学的颜晓梅教授课题组，利用她们自己制造的纳米流式细胞仪（nFCM），评估了从血浆（最难分出EV的体液之一）中分离出EV的质量和效率。她们共验证了五种广泛使用的商业分离试剂盒的性能，并将其与传统的差异超速离心（UC）进行了比较。与通过UC制备的EV相比，通过试剂盒从无血小板血浆（PFP）制备的EV颗粒浓度高出2至4个数量级，但纯度却低得多。


同时，在下图nFCM检测结果可以明显看出，用试剂盒制备的EV其粒度分布曲线与PFP的粒度分布图非常相似，说明存在较多的血浆蛋白和脂蛋白的污染，而通过UC制备的EV在相对较大的粒度下显示出较宽的粒度分布。


文中提到确认EV纯度的方法，也属于文章的一大亮点。既往较多文献提出了颗粒计数（通过NTA测量）与蛋白质含量（通过BCA分析获得）的比率，并将其用作评估EV纯度的标准。但是，NTA既无法检测到小于70 nm的囊泡，也无法区分囊泡和大小相似的脂蛋白或蛋白质聚集体，这很容易导致EV计数不准确。同时，BCA分析虽然可以测量EV的总蛋白浓度，但其中可能包括大量的脂蛋白和其他非囊泡蛋白。通过对通过UC和SEC从血浆中分离出的EV的回收率、纯度和功能潜力进行系统研究，发现颗粒/蛋白质比不是血浆EV纯度的准确测量方法。由于双层脂质膜是EV的最显著特征，作者就提出了一种简单而便捷的方法，就是通过使用nFCM分别检测用1％Triton X-100裂解EV膜之前和之后的颗粒计数，因为只有EV被破坏而信号消失，所以准确量化EV的纯度，这种单粒子方法基于光散射检测，因此不需要荧光标记。如下图b和c，EV处理前后，信号数从5062减少到1124，减少的3938可认为是EV，那么纯度就是3938/5062＝77.80％；下图的d和e是极低密度脂蛋白，不具有双层脂质膜，因此不受Triton影响，颗粒数反而增多，故纯度成负值。


综上，作者认为UC（超速离心）仍然是目前分离EV最好的方法，并提出了建议：为了将EV从血液中有效分离出来，并且避免血浆蛋白和脂蛋白颗粒污染，建议可以采用多种分离方法的组合，例如UC联合density cushion和SEC，或者是UC联合梯度密度UC。

文献源：Tian Y, Gong M, Hu Y, et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. J Extracell Vesicles. 2019;9(1):1697028. Published 2019 Nov 29. doi:10.1080/20013078.2019.1697028（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc ... /ZJEV_9_1697028.pdf）

Veblen

学习了，还是用超速离心的方法分离EV最好，然后用纳米流式可以鉴别分离出来的纯度，因为EV有双层脂质膜，能被TritonX-100破坏，所以少了的那群颗粒就是EV.