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[标本处理] 流式染色降低背景染色的方法?

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发表于 2020-1-21 09:31:49 | 显示全部楼层 |阅读模式
2流星
各位流式老师,有什么好的方法降低背景染色吗?

发表于 2020-1-21 10:07:06 | 显示全部楼层
1、保证样本活性,尽量新鲜,用死活染料,排除死细胞。
2、用Fc阻断剂。
3、洗涤液中可考虑用BSA(但效果不能保证)。

但最关键的,还是选择正确的对照,最佳的是有生物学阴性对照。
 楼主| 发表于 2020-1-21 13:00:44 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-1-21 10:07
1、保证样本活性,尽量新鲜,用死活染料,排除死细胞。
2、用Fc阻断剂。
3、洗涤液中可考虑用BSA(但效果不 ...

倪老师,我们实验室是用自己配制的皂素作为破膜剂,细胞形态和染色比例都还好,就是背景荧光强度高点,现在想把背景荧光强度降低点,像你说的加BSA效果不明显
发表于 2020-1-21 13:40:35 | 显示全部楼层
xiaoguo521521 发表于 2020-1-21 13:00
倪老师,我们实验室是用自己配制的皂素作为破膜剂,细胞形态和染色比例都还好,就是背景荧光强度高点,现 ...

你这个是胞内标记,胞内标记这些方法都没啥用的,破膜之后自发荧光就是强,这是所有的固定破膜试剂都无法避免的,所以你要注意的重点并不是降低背景荧光,而是找好生物学阴性对照,或FMO+Fc Blocking对照。
 楼主| 发表于 2020-1-21 19:29:29 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-1-21 13:40
你这个是胞内标记,胞内标记这些方法都没啥用的,破膜之后自发荧光就是强,这是所有的固定破膜试剂都无法 ...

倪老师,是的,对照可以解决这个问题!但是做出来图就没有那么好看了,破膜后自发荧光增强这个是因为什么呢,非特异性结合?还是我用皂素,皂素造成的背景过高呢?我感觉这个问题挺有意思的,但是我自己没能力解决,也没有查到相关的资料!
发表于 2020-1-21 22:06:36 | 显示全部楼层
xiaoguo521521 发表于 2020-1-21 19:29
倪老师,是的,对照可以解决这个问题!但是做出来图就没有那么好看了,破膜后自发荧光增强这个是因为什么 ...

固定和破膜造成的背景高,目前是无法解决的,因为这主要是由于固定和破膜之后,细胞的形状、膜结构发生了改变,从而造成的。
除非你找到一种不会影响细胞整体特性的固定方法。
 楼主| 发表于 2020-1-22 00:18:06 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-1-21 22:06
固定和破膜造成的背景高,目前是无法解决的,因为这主要是由于固定和破膜之后,细胞的形状、膜结构发生了 ...

按照倪老师说的,这个背景荧光强度高不是荧光染色完成,而是主要因为细胞形态和膜结构改变造成的。
发表于 2020-1-22 09:06:08 | 显示全部楼层
xiaoguo521521 发表于 2020-1-22 00:18
按照倪老师说的,这个背景荧光强度高不是荧光染色完成,而是主要因为细胞形态和膜结构改变造成的。 ...

对。
 楼主| 发表于 2020-1-22 10:26:27 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-1-22 09:06
对。

好的,谢谢倪老师的帮助
发表于 2020-2-1 02:47:15 | 显示全部楼层
试试看使用死活鉴别染料
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