流式染色降低背景染色的方法？

xiaoguo521521

各位流式老师，有什么好的方法降低背景染色吗？

niwanmao

1、保证样本活性，尽量新鲜，用死活染料，排除死细胞。
2、用Fc阻断剂。
3、洗涤液中可考虑用BSA（但效果不能保证）。

但最关键的，还是选择正确的对照，最佳的是有生物学阴性对照。

xiaoguo521521

niwanmao 发表于 2020-1-21 10:07
1、保证样本活性，尽量新鲜，用死活染料，排除死细胞。
2、用Fc阻断剂。
3、洗涤液中可考虑用BSA（但效果不 ...

倪老师，我们实验室是用自己配制的皂素作为破膜剂，细胞形态和染色比例都还好，就是背景荧光强度高点，现在想把背景荧光强度降低点，像你说的加BSA效果不明显

niwanmao

xiaoguo521521 发表于 2020-1-21 13:00
倪老师，我们实验室是用自己配制的皂素作为破膜剂，细胞形态和染色比例都还好，就是背景荧光强度高点，现 ...

你这个是胞内标记，胞内标记这些方法都没啥用的，破膜之后自发荧光就是强，这是所有的固定破膜试剂都无法避免的，所以你要注意的重点并不是降低背景荧光，而是找好生物学阴性对照，或FMO＋Fc Blocking对照。

xiaoguo521521

niwanmao 发表于 2020-1-21 13:40
你这个是胞内标记，胞内标记这些方法都没啥用的，破膜之后自发荧光就是强，这是所有的固定破膜试剂都无法 ...

倪老师，是的，对照可以解决这个问题！但是做出来图就没有那么好看了，破膜后自发荧光增强这个是因为什么呢，非特异性结合？还是我用皂素，皂素造成的背景过高呢？我感觉这个问题挺有意思的，但是我自己没能力解决，也没有查到相关的资料！

niwanmao

xiaoguo521521 发表于 2020-1-21 19:29
倪老师，是的，对照可以解决这个问题！但是做出来图就没有那么好看了，破膜后自发荧光增强这个是因为什么 ...

固定和破膜造成的背景高，目前是无法解决的，因为这主要是由于固定和破膜之后，细胞的形状、膜结构发生了改变，从而造成的。
除非你找到一种不会影响细胞整体特性的固定方法。

xiaoguo521521

niwanmao 发表于 2020-1-21 22:06
固定和破膜造成的背景高，目前是无法解决的，因为这主要是由于固定和破膜之后，细胞的形状、膜结构发生了 ...

按照倪老师说的，这个背景荧光强度高不是荧光染色完成，而是主要因为细胞形态和膜结构改变造成的。

niwanmao

xiaoguo521521 发表于 2020-1-22 00:18
按照倪老师说的，这个背景荧光强度高不是荧光染色完成，而是主要因为细胞形态和膜结构改变造成的。 ...

对。

xiaoguo521521

niwanmao 发表于 2020-1-22 09:06
对。

好的，谢谢倪老师的帮助

facetodog

试试看使用死活鉴别染料