流式分选是做亚群细胞必备的一个技术和平台。相比磁珠分选，流式分选的灵敏度和纯度要高些。我这里倒是在网上下载了一些关于分选的注意事项，抛砖引玉吧！希望各位大侠们来分享一下分选的经验！
分选倒主要是操作上的问题，分选后的细胞活性、无菌等可能是技术难题！
转载：
流式分选注意事项
二、
1.
安全性问题：由于在分选过程中，样本可能通过液滴震荡产生气溶胶，所以不接受会传播人类病原菌的生物有害样本，也不接受含放射性生物样品。
2.
应知道细胞的大小与形态，以便选择分选用喷嘴。所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的1/5，至少小于1/3。细胞的形态也会影响了分选的结果，理论上越接近于球形的细胞，分选过程中的剪切力对细胞造成的伤害就越小。形态特殊的细胞应选择较大的喷嘴，以减轻分选过程对细胞造成的伤害。 各种细胞的建议浓度和所用喷嘴如下表。 Table 1
细胞种类和浓度、喷嘴的选择 | | | Lymphocytes, thymocytes or splenocytes (直径8-12 μm) | | | Activated lymphocytes, smaller cell lines (直径12-20 μm) | | | Large adherent cell line (直径>20 μm) | | |
3.
荧光染料的选择：如选择1到4个荧光标记，一般按如下顺序选择，FITC、PE、APC和PerCP。 三、样本制备 1.
样本制备基本流程： 获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度（参考Table 1）→避光置冰上运至分选室→移入带过滤头的流式管→上机检测并设定分选条件→试分选并上机检测纯度→分选细胞。 2.
分选所用的细胞染色方法与分析所用方法基本相同，但需要注意以下几点： a）
保证样本的无菌状态，因为分选得到的细胞还要继续培养 b）
不同使用固定剂固定细胞，因为活细胞经固定剂处理后即死亡 c）
保证上机样品为单细胞悬液（我们提供带过滤头流式管 (Falcon Cat# 352235）） d）
准备充足的细胞，详见FAQ3 e）
分选缓冲液使用含2%FBS 或BSA的PBS，普通培养基中的酚红可能会干扰分选 f）
如细胞分选后需再次培养，请准备含血清的收集管，在分选前交操作员。建议在15ml离心管中加入1-2ml血清及其它必需组分，保证分选完毕时血清浓度大于5% g）
如要分选GFP等转染的样品，请提供未经转染的相同细胞为阴性对照 h）
如要做多重荧光染色标本的分选，请提供各种单一荧光染色的标本 i）
如要去除死细胞，在不影响后续实验前提下，可以加入7-AAD或是PI j）
快速简便的样本处理有利于分选：处理好的样本尽快上机，分选好的细胞尽快下一步实验，如果要分选多个样本，建议一次处理一个，估计可能的上机时间后，再处理第二个样本 四.常见问题 Q1. 上机样品需要溶在何种溶液中？是否可以就直接放在原本培养的培养基中？ Ans: 建议不要放培养基中，因为Phenol Red可能会影响分选的结果，可先尝试使用含2%FBS 或BSA的PBS作为分选缓冲液。如要求更好的细胞存活率，按分选细胞的不同，选择不同的分选缓冲液。 1.
淋巴细胞（HBSS配方中的阳离子可增进细胞的生存力。如果这些细胞并非易于群集细胞，可以选用没有EDTA的缓冲液）。 a)
1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and Mg2+) b)
1× HBSS (without phenol red) with 1% BSA c)
0.5% - 2% BSA in PBS(without Ca2+ and Mg2+) 2.
贴壁细胞（以Trypsin处理后去准备单细胞悬浮液时，待细胞变圆(切记不可过度作用)，以适量含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬浮液。离心后，用分选缓冲液调整细胞浓度。如果需要的话可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免细胞重新黏聚）。 a）
5 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and Mg2+) b）
0.5-2% BSA in PBS(without Ca2+ and Mg2+) 3.
含有高比例死细胞的样本（这些配方可减少因死细胞释放出来的DNA所造成的细胞黏聚现象。） 5mM MgCl2, 1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0), 25-50 μg/mL DNAase I and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and Mg2+) 4.
建议询问有经验者（使用相同细胞进行过分选）的分选缓冲液配方 Q2. 如果细胞要再培养，会污染吗？ Ans: 分选所用的所有溶液都经高温高压灭菌，流式分选仪管路使用70%乙醇定期清洗，仪器所在房间在每次分选前紫外灭菌，最后在细胞培养基中加入抗生素，可将污染机率降至很低。 Q3. 如果我想在分选后拿到1×106的细胞我应该一开始准备多少细胞去做分选？ Ans: 假设你要的细胞只占总数的10%，则你所需准备的细胞数如下公式: 1×106=10%× 50%回收率× 20×106(起始细胞数)，所以你需要准备2×107细胞。高速分选、纯度模式(purity vs. yield mode)、部分细胞黏附于上样管壁、部分细胞用于样本分析、长时间分选过程中细胞的死亡等等，对会降低回收率。50%回收率是一个一般的参考值。 Q4. 通常做一次细胞分选需要多久时间？ Ans: 分选的过程有三个步骤，分别为设定分选区域、分选及分选后的分析。设定分选区域约需15-20分钟。分选的时间决定于细胞数目，虽然机器的分选速度最高可达70,000细胞/sec，但为得到最佳分选结果，我们通常设定分选速度为10,000-20,000细胞/秒。因此，如欲分选2×107细胞，其所需分选时间约为17-34分钟。分选后约需15-20分钟去分析及打印结果。所以，总共约需1-1.2小时去分选2×107细胞。 Q5. 一个样品可以同时分选出几种细胞? Ans: FACSAria可以从一个样品中最多同时分选出四种不同的细胞。 Q6. 可以同时使用多少参数进行细胞分选？ Ans: FACSAria最多可以根据15个参数去定义及分选一群细胞 (检测488 nm 激光对应的5种荧光信号及SSC和FSC，监测633 nm 激光对应的2种荧光信号，检测375nm 激光对应的2种荧光信号，另有四个可扩充的空白通道)。 Q7. 分选后细胞的纯度有多少？ Ans: 通常可以达到95%以上的纯度，如果所分选细胞可以和其他细胞群较好的区分。 Q8. 如果阳性的细胞占总数的1%以下，还可以做分选吗？ Ans: 可以，但是低含量细胞的分选会导致低纯度及低回收率。因此，我们建议使用者事先富集你感兴趣的细胞。细胞富集的方式可以是正选：如用磁珠法富集你感兴趣的细胞；也可以是负选，如利用nylon wool去除B细胞，或磁珠法去除不要的细胞。 Q9. 分选时所使用的管子有哪些？ Ans: 上样一般使用我们提供的带滤网5ml流式管；收集可以使用下面这三种管，15ml离心管(最多双路分选)，5ml带盖流式管(Falcon tube #352003) (最多四路分选)，或1ml Microtube(最多四路分选)。 Q10. 可不可以把分选后的结果文件带走？ Ans: 可以，提供FCS 2.0或3.0格式的流式分析结果，邮件发送或提供下载，进一步分析可使用免费软件WinMDI或商业软件Flowjo和FCSExpress软件。
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发表于 2011-3-11 10:35:03
都是浮云，没有分选的机器
发表于 2011-3-13 20:23:08
