小鼠肿瘤模型回输T细胞血液检测不到T细胞

wanng

CAR-T回输，小鼠生存率延长，但是从始至终在小鼠外周血中都检测不到人源CD3的表达，也试过不同克隆号，出现这个现象的可能有什么？

niwanmao

你们的CAR-T在制备出来之后，有没有检测过CD3？

wanng

niwanmao 发表于 2020-2-10 19:01
你们的CAR-T在制备出来之后，有没有检测过CD3？

测过，90%以上，car的转导效率也很高

niwanmao

wanng 发表于 2020-2-11 09:50
测过，90%以上，car的转导效率也很高

那么你回输之后的检测，样本处理步骤是如何的？

wanng

niwanmao 发表于 2020-2-11 11:28
那么你回输之后的检测，样本处理步骤是如何的？

血液瘤模型，回输CAR-T后，第七天每隔一周检测外周血，先是裂红，国产的裂红液，室温五分钟，300g*5分钟，两次，最后只剩下白细胞团块。用10%血清4度封闭半个小时，加入CD3抗体1：50或者1：25，用过OKT3，UCHI, HIT3克隆号。不固定直接上机检测

niwanmao

wanng 发表于 2020-2-11 13:13
血液瘤模型，回输CAR-T后，第七天每隔一周检测外周血，先是裂红，国产的裂红液，室温五分钟，300g*5分钟 ...

其它抗体都没？
这里就有个问题，因为虽然你回输的细胞量可能会比较多，但是到了小鼠体内，一个会稀释，另一个可能会分散到组织中，所以你最后采到的小鼠血里面，含量肯定不会多，我的建议是最好加一个小鼠的白细胞共同抗体（例如抗小鼠CD45），将小鼠的细胞排除掉之后，再分析，这样会更好。而且要切记，细胞量一定要取得足够多。

wanng

niwanmao 发表于 2020-2-11 19:48
其它抗体都没？
这里就有个问题，因为虽然你回输的细胞量可能会比较多，但是到了小鼠体内，一个会稀释， ...

后期我们CD3不能成功染色，我们加了人源CD45去确定T细胞，并没试过鼠源的CD45，能看到一点分群，但后期证实这一群CD45阳性细胞是建立小鼠模型用的人源细胞系所表达的，并不是T细胞表达。

虽然说打进去的细胞会在体内稀释，但是毕竟经过一周以上的时间，T细胞也会大量增殖，并且是血液瘤模型，有抗原存在，更会促进CAR-T的增殖。

小鼠外周血我们取了100ul，裂完红很明显的白细胞团块，收集记录了100000个细胞。

zengyikaren

wanng 发表于 2020-2-12 16:16
后期我们CD3不能成功染色，我们加了人源CD45去确定T细胞，并没试过鼠源的CD45，能看到一点分群，但后期证 ...

很可能是你的CART并没有在小鼠体内大量增殖，而是打进去后仅仅在小鼠体内发挥了共孵育的杀伤作用就死掉了。你可以打进去4h，24h就检测一次，可以检测到。

niwanmao

wanng 发表于 2020-2-12 16:16
后期我们CD3不能成功染色，我们加了人源CD45去确定T细胞，并没试过鼠源的CD45，能看到一点分群，但后期证 ...

理论和现实总是有差距的，所以才需要做实验。
可能如@zengyikaren  站友所说的那样，CAR-T并没有发生增殖，因为在临床上CAR-T回输病人体内后，也经常出现这种情况，因为T细胞已经是终末期细胞了，你期待它们发生增殖，可能性太小，除非你输入的T细胞是TSCM阶段的。