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流式细胞学,天天接触,很熟,那么流式病毒学呢?

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发表于 2020-2-18 22:55:35 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式细胞仪的传统用途是检测细胞及其抗原。然而,随着流式细胞学技术的进展,现在很多机器已经可以检测100 nm至1000nm之间的微粒,这些微粒可以是细胞的成分,例如外泌体,也可以是入侵细胞的生物,例如小细菌或病毒。
病毒和/或病毒颗粒通常通过透射电子显微镜(TEM)、荧光显微镜(EFM)、ELISA、病毒滴定分析、蛋白质印迹分析和PCR方法等进行检测,但是,这些方法大多分析的是一个群体,而不是单病毒,并且这些技术通常需要繁琐的样品制备过程,而且无法分析各类病毒比例,无法区分具备感染能力的病毒与非感染性病毒颗粒。
流式病毒学是指使用流式细胞仪检测病毒颗粒,它能够直接检测单个病毒颗粒及其特征。像常规的流式细胞仪染色程序一样,通常首先将病毒分离并与染色试剂一起孵育,然后通过可检测病毒颗粒的流式细胞仪进行分析。


第一阶段:早期病毒检测
早期的流式细胞仪在可检测样品的大小和类型上有很大的限制。直到1979年Hercher等人设计了一种定制的流式细胞仪后,病毒的检测才成为可能。该细胞仪的构建是通过微升泵使病毒流过含有鞘液的毛细管,并使用显微镜放大镜将激光聚焦并放大毛细管的观察平面。使用这种定制的流式细胞仪,Hercher等人基于光散射图谱,从背景噪声或呼吸道肠道病毒(60-80 nm)中,区分出T2噬菌体(头60 nm,尾部120 nm)。尽管通过光散射特性进行病毒检测是可能的,但基于光散射曲线无法确定太多信息。然而,能够检测病毒的流式细胞仪的开发是开启新研究领域的第一步。


第二阶段:早期的病毒染色
具有微毛细管流体系统的流式细胞仪的发展和更强的激光器,以及稳定和优异的DNA染色染料的发现,使得可以用荧光标记检测病毒。 1999年,Marie等人用SYBR Green-I核酸染色剂标记海洋噬菌体,将流式细胞仪检测病毒的能力进一步扩展到来自不同家族的病毒,例如杆状病毒科、疱疹病毒科、肌病毒科、粘病毒科、小RNA病毒科、短尾病毒科、逆转录病毒科和长尾病毒科。 随着更稳定和强荧光的核酸染色剂(例如SYBR-Gold)的出现,海洋病毒得以更好的染色标记和检测。 在上述研究中,通过基因组染色将病毒可视化。 但是,只能成功检测到DNA病毒(较大的病毒)。


第三阶段:用微球捕获病毒
流式病毒学的进一步发展,就是用微球捕获病毒。 在较早的研究中,使用普通微球与抗体的结合,后来的研究中使用离散大小的磁性纳米颗粒。病毒颗粒表面抗原与荧光素标记抗体结合后,被微球/纳米颗粒捕获,从而可直接拿来检测。 Yan等人使用与抗体相结合的微球来捕获和区分甲型流感病毒和乙型流感病毒。 另一研究小组使用磁性纳米颗粒捕获HIV-1和登革热病毒。 这些研究为检测病毒表面的病毒糖蛋白开辟了新的流式病毒学领域。


第四阶段:使用抗体直接检测病毒颗粒
Landowski等人最先实现了单独使用抗体直接检测病毒样颗粒(VLP)。 Nipah VLP被纯化并用一抗和二抗染色,并通过能够进行小颗粒检测的流式细胞仪进行检测。 这是病毒颗粒第一次用抗体染色,无需使用微球即可检测病毒糖蛋白。 次年Gaudin等人使用类似的流式病毒分析方法,使用一种非中和性抗体来识别Junin病毒糖蛋白,从而检测Junin病毒。


第五阶段:分选病毒
Allen、Khalil和Gaudin小组更进一步,分别对噬菌体、海洋阿米巴病毒和Junin病毒进行了分选。Allen将λ和T4大肠杆菌噬菌体混合,然后进行分选,并进一步进行下游基因组鉴定。 Khalil从阿米巴共培养的上清液中成功地分离出了拟病毒和塞德病毒。 Gaudin将Junin病毒分选到孔板中,然后通过电子显微镜分析颗粒大小,最后形成反映病毒大小、病毒表面糖蛋白和脂质含量的传染性特征。 同样,Bonar等人将流式病毒分选应用于HIV-1的检测,并进一步分选出了HIV病毒,重要的是,分选得到的HIV-1保留了传染性。 此外,Bilali等人报道了高水平的HSV-1内膜蛋白VP16和VP22与感染性之间的相关性。



文献报道在病毒检测中用过的流式细胞仪型号以及使用简介
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流式细胞仪要做的准备
无论研究人员是使用先前报道过的流式细胞仪还是其他流式细胞仪,第一步是得确定流式细胞仪是否可以将小颗粒与背景噪声区分开。通常需要使用干净的缓冲液(已事先用超速离心或排阻孔过滤器过滤)清洗流动室,鞘液全部改为这类缓冲液,流式细胞仪上的检测设置和电压也都需要加大,样本处理也都要用这种干净的缓冲液。
最后上机确认,如下图所示,碎片和100nm微球,应该能绝大部分能分开:
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分析前进行病毒稀释和设置调整
一旦确定流式细胞仪可以将100nm微球与背景噪音区分开,就可以对病毒进行分析。可以根据需要的分析类型以各种方式制备病毒样品,可以培养或从天然来源中提取病毒样品。但是,在制备样本前都应该先稀释病毒。适当稀释病毒,最好是稀释到100-1000个事件/秒或100-500个事件/秒,以提高信噪比,避免与噪音重合,从而获得最佳结果。另外,降低样品的流速会增加信噪比(流式可参考前面这张流式细胞仪列表)。


病毒的核酸染色方法
早期的染色方法包括用核酸染色试剂标记病毒。但是,这种方法对较大的DNA病毒效果更好。整个染色过程需要从培养物中制备病毒,将其固定然后冷冻,然后将冷冻的病毒解冻,并在80°C条件下用低浓度去污剂(Triton X-100,浓度为0.1%)处理,用SYBR Green-I或SYBR Gold标记。有些研究小组于25°C下孵育培养过夜,标记SYBR Green,成功地将阿米巴病毒染色成功。
对于Junin病毒等RNA病毒,可以采用YOYO-1或者Styryl-TO标记。


病毒的微球标记法
羧基化的微球先结合病毒表面蛋白特异的抗体,然后再去结合病毒。如下图,A图是用FSC/SSC物理参数,无法区分出病毒颗粒,而B图用病毒特异性糖蛋白标记后,就能很好地区分出病毒颗粒(右下图):
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直接标记病毒
下图是针对VLP病毒的染色结果(A图PBS,B图单标F蛋白,C图单标G蛋白,D图双标)。首先,将病毒与一抗孵育,然后与荧光素偶联的二抗孵育。由于洗涤步骤包括非常耗时的超速离心步骤,因此建议使用荧光素的一抗进行直标,减少洗涤次数,而且,单价Fab片段可以减少与二价mAb的使用和多重染色程序相关的背景,并防止形成病毒颗粒聚集体。
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流式病毒学的应用
应用包括病毒计数、从环境中区分病毒种群、确定病毒糖蛋白和病毒颗粒的脂质组成。  随着新式流式细胞仪的出现,病毒分选成为可能。 病毒的分选使研究人员能够根据病毒大小将病毒分离,并将此大小与传染性相关联,并区分不同的病毒微粒。
最最重要的,象这次新冠病毒疫情,后续的疫苗制备企业需要赶紧制备出针对新冠病毒特异性的疫苗。那么如何避免疫苗中混入病毒呢?如何知道疫苗中出现的颗粒是病毒还是其它杂质呢?如何保证疫苗质量呢?就用流式病毒学,结合荧光标记和光散射特性,可以区分出病毒,并且了解病毒是否有感染性,故可用于疫苗质量保证,以生产包含最佳病毒颗粒(非感染性病毒颗粒)的疫苗。流式病毒学还可以为疫苗的储存提供指导:报告显示,经过多次冻融的病毒制剂容易出现聚集体形成增多。同样,流式病毒学检测还可用于测试冻干对病毒疫苗制品的影响。

参考文献:Zamora JLR, Aguilar HC. Flow virometry as a tool to study viruses. Methods. 2018;134-135:87–97. doi:10.1016/j.ymeth.2017.12.011
发表于 2020-2-23 19:44:02 | 显示全部楼层
本帖最后由 Veblen 于 2020-2-23 19:51 编辑

1. 想请问一下 在80°C条件下用低浓度去污剂(Triton X-100,浓度为0.1%)处理,
这里的Triton X-100的作用?
2. 流式病毒学的应用中病毒颗粒的脂质组成,这一点流式怎么能做到呢?
3. 病毒的分选使研究人员能够根据病毒大小将病毒分离,并将此大小与传染性相关联,想请问一下病毒的大小与病毒的传染性有什么关系呢?


 楼主| 发表于 2020-2-23 21:48:21 | 显示全部楼层
Veblen 发表于 2020-2-23 19:44
1. 想请问一下 在80°C条件下用低浓度去污剂(Triton X-100,浓度为0.1%)处理,
这里的Triton X-100的作 ...

1、Triton是去污剂,有助于核酸染料染上。
2、病毒颗粒的脂质成份不是流式的研究范畴。
3、大小是指同一种病毒,反映的是病毒的状态,与传染性的关联可以查看相关研究。
发表于 2020-2-25 21:05:28 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-2-23 21:48
1、Triton是去污剂,有助于核酸染料染上。
2、病毒颗粒的脂质成份不是流式的研究范畴。
3、大小是指同一 ...

学习了,谢谢老师。
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