肝脏巨噬细胞

blue_sky2535

各位前辈大家好，我一直研究的是C57小鼠肝脏巨噬细胞，但是对肝脏造模后，提取肝脏巨噬细胞去做流式，F4/80一直标记不上，而且用石蜡切片进行F4/80染色也染不上，重复做了好多次，一直做不出来，想请教下各位前辈是什么原因，这是我提取巨噬细胞的方法以及流式结果，免疫组化的F4/80也一直染不上

流式步骤：

1、提取小鼠肝脏，轻轻剪碎后，用0.025%四型胶原酶在37℃进行孵育一小时

2、用200目的皿将其研磨碎，用1乘PBS将其稀释，3000转离心10分钟

3、将上清弃去，将下层吹打混匀

4、用30%和70%Percoll进行分离，2000转离心40分钟

5、取中间层细胞用1乘PBS进行稀释，3000转离心10分钟

6、取沉淀用500ulPBS重悬，加入红细胞裂解液4℃裂解

7、离心后用100ulPBS重悬，加入F4/80抗体室温孵育半小时，上流式
请各位前辈指教，万分感谢

niwanmao

1、用PerColl分离就很可能没分到巨噬细胞，被丢失了。
建议消化后，过滤成单细胞悬液之后，直接标记检测。
2、设门的P1门请扩大，并且建议加标PI或商品化死活染料，去掉死细胞。

tiger

niwanmao 发表于 2020-3-8 16:02
1、用PerColl分离就很可能没分到巨噬细胞，被丢失了。
建议消化后，过滤成单细胞悬液之后，直接标记检测。
...

倪老师说的对，去掉PerColl分离步骤，另离心控制在350-400G5分钟即可，你可能离心力太大。加CD45，用CD45设门分析目的细胞。

blue_sky2535

niwanmao 发表于 2020-3-8 16:02
1、用PerColl分离就很可能没分到巨噬细胞，被丢失了。
建议消化后，过滤成单细胞悬液之后，直接标记检测。
...

嗯嗯，万分感谢前辈的回复，还想请教下如果直接用一种PI对细胞活性进行鉴定，但PI无法区分凋亡细胞，这个对结果影响大么？

blue_sky2535

tiger 发表于 2020-3-9 15:55
倪老师说的对，去掉PerColl分离步骤，另离心控制在350-400G5分钟即可，你可能离心力太大。加CD45，用CD45 ...

嗯嗯，谢谢前辈的回复，那如果直接拿单细胞悬液去上流式，细胞量太大，是否孵育抗体前需要对细胞进行计数？用CD45阳性细胞设门后，再进行F4/80的检测么？

niwanmao

blue_sky2535 发表于 2020-3-9 22:44
嗯嗯，万分感谢前辈的回复，还想请教下如果直接用一种PI对细胞活性进行鉴定，但PI无法区分凋亡细胞，这个 ...

没理解什么意思。用PI把死细胞排除掉之后，你才能更准确地分析真正的巨噬细胞比例啊。

blue_sky2535

niwanmao 发表于 2020-3-10 08:16
没理解什么意思。用PI把死细胞排除掉之后，你才能更准确地分析真正的巨噬细胞比例啊。 ...

前辈好，因为PI只能把坏死细胞显示出来，而凋亡细胞和活细胞都是PI阴性的，凋亡细胞会不会影响结果？请前辈多多指教，感谢感谢

niwanmao

blue_sky2535 发表于 2020-3-11 14:46
前辈好，因为PI只能把坏死细胞显示出来，而凋亡细胞和活细胞都是PI阴性的，凋亡细胞会不会影响结果？请前 ...

你的实验目的究竟是什么？巨噬细胞的凋亡一般不太有人去检测的。

blue_sky2535

niwanmao 发表于 2020-3-11 15:34
你的实验目的究竟是什么？巨噬细胞的凋亡一般不太有人去检测的。

嗯嗯，谢谢前辈的提醒，我的实验目的就是想检测肝脏巨噬细胞的分型，检测其表面分子，那凋亡细胞应该影响不大。前辈，我想问一下用PI或7-AAD都是先标记抗体，再裂解红细胞，去上清，最后上机前，与7-AAD染液或PI染液孵育5分钟，就可以立即上机么？（我标记的细胞分子都是表面标记物）

niwanmao

blue_sky2535 发表于 2020-3-11 20:56
嗯嗯，谢谢前辈的提醒，我的实验目的就是想检测肝脏巨噬细胞的分型，检测其表面分子，那凋亡细胞应该影响 ...

对。