求各位大佬指点下凋亡

gengren163

我用一种抗肿瘤药物处理了肿瘤细胞，24小时后显微镜下可以看出低中高浓度时细胞漂起的数量与剂量关系很明显。但是做了几次凋亡（invitrogen300t试剂盒，收集S洗培养液，无EDTA胰酶消化，PB2次后190ul Buffer重悬，5ul Annexin-v染色10分钟后加入10ul PI，上机，bechman cytoflex流式机），图都不理想。主要问题是在FSC-SSC图上可见在正常细胞和凋亡细胞中间出现一条不明状态的细胞，在FITC-PI图中这一群细胞出现在右下象限，导致图像早凋亡区比例超高，不知道是在细胞处理过程还是流式检测过程出的问题。请各位大神指点一下。

                               
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我标了红色的是一般情况下正常和凋亡细胞的位置，夹在中间橙色的那部分细胞是怎么回事？

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niwanmao

1、浮起来的细胞也都要收集的。
2、最左下角的那些是碎片，可以不圈，只圈右侧从淋巴细胞开始的区域。
3、你这里的Annexin V分得确实不好，可以PBS洗涤两次之后上清尽量去干净，然后Annexin V染色时间延长到20分钟再试试 。

gengren163

niwanmao 发表于 2020-3-28 17:28
1、浮起来的细胞也都要收集的。
2、最左下角的那些是碎片，可以不圈，只圈右侧从淋巴细胞开始的区域。
3、 ...

谢谢老师指点，我收集了漂浮细胞，PBS洗完也是用小枪头尽量吸干净了才加的Buffer，下次我染20分钟试试吧，从散点图感觉这个细胞分布就很奇怪