关于补偿的几个关键点

niwanmao

补偿对照荧光素的光谱应与实验抗体的一致
更准确地说，补偿对照和实验抗体的荧光素应完全相同，而不仅仅是相似。 例如，即使AlexaFluor®R488和FITC在光谱上非常相似，AlexaFluor®R488补偿对照也不能用于FITC的补偿调节，反之亦然。 其他的例如APC和AlexaFluor®R647不能相互代替，APC-Cy7和APC-H7不能相互代替。
对于串联试剂（例如PE-Cy7、APC-Cy7），不同批次之间存在很大的光谱差异，这可能会导致SOV的差异，因此，建议用户每个批次都要跑一下单染做补偿。

阳性群和阴性群的自发荧光必须相等
溢出值（SOV，Spillover Value）计算时，是假定溢出检测器的平均荧光强度中的任何差异只由荧光染料不同引起。 如果自发荧光不同，则溢出检测器中MdFI（平均荧光强度）的一部分将由自发荧光的差异引起，而不是单纯荧光染料本身。
下表就是一个典型的例子，在使用相似自发荧光的阳性和阴性细胞测量FITC漏到PE的SOV时，计算出的SOV为27％。 但是，阴性群体如果错误地使用了微球，就会导致SOV为22％，两者之间的SOV相差5％。


同样的，细胞类型也需要尽量一致，例如细胞系和原代淋巴细胞就不能作为相互的对照，再如计算淋巴细胞某标记的SOV时，就不能用单核细胞来作为阳性或阴性对照。
此处有一个常见的误解：SOV取决于您所分析的细胞类型和自发荧光。
这是错的。 SOV仅取决于荧光染料本身的特性。 正确测量后，SOV与生物学样品中的细胞类型无关。上面所说的只是要求阳性和阴性细胞群均要采用同一种细胞，从而保证SOV的正确性，无论用什么细胞，最后的SOV值都是一样的。

阳性群体应尽可能强
如下图所示，SOV等于两个检测器的MdFI的斜率（虚线，Slope），所以说，SOV并不会随着强度增强而增大，而是在整个动态范围内都是相同的。 正确的SOV可以提供正确的补偿，无论应用的群体是强表达的还是弱表达的。
之所以平时让大家尽量强的阳性群体，是因为当计算斜率时，阳性和阴性两个数据点离的远，可获得更准确的测量值（即SOV）。 这对于低溢出值（例如PE-Cy7到PE）尤其重要。

但是，我们很少能获得“完美”的SOV，如上图所示，随着主检测器MdFI的增加，SOV中任何误差的影响都会放大。在此例中，如果补偿误差不足1％， SOV将对弱表达群体影响很小，比如当FL1中的MdFI为10E3时，FL2中误差就达到了10 MdFI，忽略不计；但是，如果FL1的MdFI为10E5，则FL2的MdFI误差为1000，有时候可能会被误认为PE阳性群体。

收集足够的事件以获得有意义的准确SOV
根据经验，阴性和阳性群体至少要收集5000个事件，这是为了确保测量的准确性，尤其是对于低SOV的荧光素抗体。


参考文献：Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019;49(10):1457–1973. doi:10.1002/eji.201970107

maomaocat

老师您好，我有些地方没能理解清楚，我想问问
关于第二幅图，在补偿误差不足1%的存在下，不是平均荧光强度越强，它的误差就越大吗？那为什么说要用强的阳性群体。

niwanmao

maomaocat 发表于 2020-4-2 12:04
老师您好，我有些地方没能理解清楚，我想问问
关于第二幅图，在补偿误差不足1%的存在下，不是平均荧光强度 ...

所以说用强的群体来调节，可以有效纠正这个误差。而弱的群体看不出这个误差，容易忽略掉 。

maomaocat

niwanmao 发表于 2020-4-2 16:06
所以说用强的群体来调节，可以有效纠正这个误差。而弱的群体看不出这个误差，容易忽略掉 。 ...

谢谢老师的解答。意思是说，如果仪器做自动补偿时会有这种误差的发生，用强阳性的群体做补偿的话，就可以看出这种误差，然后再手动调节纠正就可以了，我这样的理解对吗？

niwanmao

maomaocat 发表于 2020-4-3 08:59
谢谢老师的解答。意思是说，如果仪器做自动补偿时会有这种误差的发生，用强阳性的群体做补偿的话，就可以 ...

对的，用强阳性更容易看出误差，从而使得补偿调节更准确。

returnglory

感谢老师分享，

maomaocat

niwanmao 发表于 2020-4-3 09:53
对的，用强阳性更容易看出误差，从而使得补偿调节更准确。

喔喔~谢谢老师的解答

陈景飞

倪老师，您好，这句话的意思没有太明白“同样的，细胞类型也需要尽量一致，例如细胞系和原代淋巴细胞就不能作为相互的对照，再如计算淋巴细胞某标记的SOV时，就不能用单核细胞来作为阳性或阴性对照。”
比如说我检测某组织的中性粒细胞（用cd11b, ly6G这两个marker），我用的是本身的这个组织来调补偿。如果我选择中性粒细胞所在的位置来调补偿就会导致背景很高，这样高背景的情况下，我是否可以选择淋巴细胞来调节补偿，但是跑样完后分析的是中性粒细胞？

陈景飞

还有关于“阴性和阳性群体至少要收集5000个事件”，这个适用于所有的流式实验吗，如果阳性率低的话 收集5000很费时间。怎么计算多少才是又经济又有效的？谢谢老师

Sarah

老师，你好，有几个问题想请教一下：
1. 最近我需要收集小鼠的鼻组织和肺组织来做流式，我需要调补偿。那我是可以用脾细胞来调补偿是吗？脾细胞的CD11b或者Ly6G这些分子的表达比较少，所以我会用带有相同荧光的CD3这种高表达的抗体来调补偿，但是这样调出来的补偿看起来是很漂亮，但是一旦用到自己的实验样品去跑，就会发现还是有一点问题，我忘记具体是什么问题了，我的意思是这个调好的补偿可能更适合用脾细胞上机，而不是其他组织，所以像这种无法避免的问题要怎么办？
2. 老师，我想看鼻组织和肺组织里感染后的免疫细胞类型，比如DC，Macrophage，Neutrophil，T, B, 但是文献里的maker多种多样，各有个的定义细胞的marker，像中性粒，有些文章用Ly6G+/Ly6G+定义，有些用CD11b+/Ly6G+来定义；像肺组织里面的巨噬就有肺泡型和间质性，它们的marker就又不一样，而在别的组织，比如脾脏，巨噬就不属于这两种；在鼻组织，我不知道这里的巨噬的marker是否跟脾脏的一致？有些文章比较肺组织和鼻组织的巨噬，还弄出一个Ly6G-/+的巨噬，我就更迷惑了，所以我不清楚在不同的组织里，我应该挑选那种marker定义细胞？像DC，又有几种亚群，而我应该是先总的来看，还是直接细分亚群来看？