流式荧光染料分哪几类？

niwanmao

流式细胞学的发展，最重要的促进力量是抗体，其次就是与仪器检测能力配套的荧光染料。荧光染料目前仍跟不上仪器检测通道数量的发展。

现有的流式荧光染料可分为以下11大类：
1、有机小分子
提起有机小分子，大多数人肯定一头雾水，但是如果我举出几个例子，肯定恍然大悟。
FITC（分子量389 Da）、Alexa Fluor 488（FITC类似物，分子量643 Da）、Texas Red（TxRed，分子量625 Da）、Alexa Fluor 647（分子量1155 Da） 、Pacific Blue（分子量242 Da）和Cy5（分子量762 Da）。是不是基本上都用到过？
这些有机小分子具有一致的发射光谱和较小的斯托克斯位移（激发波长和发射波长之间的差，大约为50-100 nm），光稳定好，容易与抗体偶联，所以应用广泛。
值得一提的是Alexa Fluor染料光稳定性较FITC更好，所以如果要做成像的话，可选择它们。

2、藻胆蛋白
藻胆蛋白（Phycobiliproteins）是从蓝藻、鞭毛藻等藻类中提取的大蛋白分子，例如藻红蛋白（PE）的分子量为240,000 Da。 这些蛋白质具有较大的斯托克斯位移（75-200 nm），并且具有稳定的发射光谱。 由于藻胆蛋白较大，因此它们在结合过程中通常具有1：1的蛋白质与荧光染料比率，因此对于定量流式细胞术非常有用。
但是，藻胆蛋白易受光致漂白，因此不建议长时间或反复暴露于激发光源中。
藻胆蛋白家族中，除了藻红蛋白（PE）外，还有别藻蓝蛋白（APC）和苦瓜素叶绿素蛋白（PerCP）。

3、量子点
量子点（Qdots）是半导体纳米晶体，具有与纳米晶体尺寸密切相关的荧光发射光谱。 它们最适合被紫外或紫光激发，但也容易被其它激光少量激发，因此，在多参数实验中使用Qdots时，其它波长激光器的这种微小激发，却会使荧光补偿变得复杂。
正是如此，虽然量子点染料亮度高，但由于这些补偿问题难以解决，并且将Qdot结合到抗体上较为困难，所以这些试剂在多参数方案中大多被高分子染料取代。

4、高分子染料
高分子（聚合物）染料由收集光信号的聚合物链组成，可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基，“调节”吸收和发射特定波长的光。 这些染料非常稳定，并且与藻胆蛋白具有相似的量子效率，光稳定性大大提高。
由于可以使聚合物染料仅吸收特定波长的光，因此避免了Qdots存在的跨波长激发的问题。
高分子染料中典型的代表是Brilliant Violet (BV)、Brilliant Ultraviolet (BUV) 和Brilliant Blue (BB)。

5、串联染料
串联染料将藻胆蛋白（PE，APC，PerCP）或高分子染料（BV421，BUV395）与有机小分子荧光染料（Cy3，Cy5，Cy7）化学偶联，利用荧光能量转移（FRET），形成单激光激发更多波长的发射光。
例如，Texas Red的最大激发为589 nm，而PE的发射为585 nm，因此通过将PE与Texas Red耦合，PE的发射光通过FRET激发Texas Red，从而使PE-TxRed可用488 nm或532 nm的激光器激发。
高分子抗体也可使用相同的方法串联有机小分子染料。
串联染料非常亮，具有较大的斯托克斯位移值（150-300 nm），这在检测低密度的抗原时非常有用。但是，串联染料的稳定性不如供体荧光染料，并且能量转移效率因批次而异，使补偿复杂化。

6、重金属离子
重金属离子严格说起来不算荧光素，但是我们也在此一起提一下。
用于质谱流式的抗体，不是用荧光素结合的，而是与镧系元素系列中的单个同位素重金属离子结合。 目前商业上有35种镧系元素同位素可用于抗体偶联。 这些探针是非荧光性的，仅适用于质谱流式分析。

7、荧光蛋白
荧光蛋白经常用作基因表达的报告系统。最常用的是来自维多利亚水母（Aequorea victoria）的绿色荧光蛋白（GFP）。 由此衍生出CFP和YFP。

红色荧光蛋白（DsRed）来自蘑菇海葵Discosoma，从DsRed衍生出下一代单体荧光蛋白（mCherry，mBanana），并具有更宽的激发和发射光谱。
随着基因克隆技术的成熟，目前荧光蛋白已有数百种，其激发和发射光谱范围从紫外线到近红外。

8、核酸染料
核酸染料结合DNA、RNA或两者均结合。 它们可用于定量DNA进行细胞周期分析（如PI，7-AAD，DyeCycle Violet，DAPI），分选染色体（如Hoescht 33342， Chromomycin A3），利用侧群分析对干细胞进行分选（如Hoescht 33342），死活细胞区分以及对细菌进行分选。
将核酸染料与另一种标记物（例如荧光染料偶联的抗溴脱氧尿苷（BrdU））结合使用，能确定增殖水平。


9、细胞增殖染料
用BrdU（溴脱氧尿嘧啶核苷）孵育细胞，使其掺入细胞DNA合成过程，然后用针对BrdU的抗体和DNA染料染色，便可测量细胞增殖。 但是，此方法不适合长期增殖研究。
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。CFSE染料的红色和紫色变种现在也已经有了。这些染料在合适的浓度下，不影响细胞生长或形态，适合长期增殖研究。


10、细胞死活染料
细胞活力可以通过排除性染料（如碘化丙啶、DAPI）确定，也可通过染料与细胞内胺类物质的结合检测。
排除性染料不能固定，仅适用于无感染性且需立即分析的细胞。
胺类染料包括Live/Dead（ThermoFisher），Zombie（Biolegend）或Fixable Viablity（BD Biosciences），适用于固定的细胞，因此适合那些有传染性细胞、胞内抗原染色的细胞、多聚甲醛固定的细胞。


11、钙指示剂染料
钙指示剂染料与钙结合后会发生色移，可用于指示细胞激活和信号传导。
最常用的染料仍然是indo-1，即紫外双相钙探针。 另外还有fluo-3的Blue-green calcium probes。


文献来源：Current Protocols in Immunology，Chapter 5.1.4, Flow Cytometry: An Overview