在科研上，流式究竟有哪些15大用途？

niwanmao

1、免疫表型分析
流式细胞仪最常用于免疫表型分析，可以同时分析免疫细胞混合群体的多个参数。 免疫表型最简单的形式，是用荧光染料偶联抗体标记细胞表面抗原。 Human Leukocyte Differentiation Workshops给这些抗原中的大多数赋予“分化簇”编号（CD编号），以便使用通用的命名法来定义针对特定细胞抗原的单克隆抗体。 例如，CD3是“分化簇3”，用于定义存在于所有T细胞上的T细胞共受体。

大多数免疫细胞具有特定的系列特异性CD标记，被称为谱系标记物。例如，T细胞标志物（CD3，CD4，CD8），B细胞标志物（CD19，CD20），单核细胞标志物（CD14，CD11b）和NK细胞标志物（CD56，CD161）。

除了定义免疫细胞群的谱系标记外，其他标记还用于表征每个细胞群的功能。这些标记可以包括活化标记（CD69，CD25，CD62L），记忆标记（CD45RO，CD27），组织归巢标记（α4/β7）和趋化因子受体标记（CCR7，CCR5，CXCR4，CCR6）。

免疫表型实验通常还包括细胞内标志物，例如FoxP3（定义Treg细胞），细胞因子（IFN-γ，TNF-α，IL-2定义TH1细胞），增殖标志物（Ki67，CFSE）和抗原特异性标志物（主要组织相容性或MHC四聚体）。目前的流式仪器和试剂能够进行28种颜色免疫表型实验，尽管最常见的是在12-15种颜色范围内进行实验。

2、抗原特异性反应
可以通过用特定抗原刺激免疫细胞，然后通过MHC多聚体寻找免疫细胞产生细胞因子、增殖、活化、记忆或抗原识别功能，从而衡量抗原特异性反应。 MHC多聚体通常是生物素化的MHC单体（MHC-I或MHC-II）以4个（四聚体，tetramer）、5个（五聚体，pentamer）或10个（十聚体，dextramer）的形式与荧光链霉亲和素骨架结合。 这些MHC多聚体“加载”所选抗原，然后与识别抗原的T细胞结合，从而表明对特定抗原的反应水平。 该应用通常用于疫苗研究。

3、细胞内细胞因子分析
通过用蛋白转运抑制剂（布雷菲德菌素A或莫能菌素）处理免疫细胞2～12小时来，可以使细胞内细胞因子产生后不会分泌出来，而是积聚在细胞内，从而实现更好的检测。 在此孵育过程中，可用各种抗原刺激细胞， 例如疫苗的肽段，以衡量免疫反应。

蛋白质转运抑制剂处理后，对细胞进行活性标记和细胞表面标记染色，然后进行固定和透化，用抗细胞因子抗体进行细胞内染色。

4、增殖分析
在流式上，细胞增殖可以使用几种不同的方法和标记物测量。这些测定方法使用与增殖有关事件，例如将胸苷类似物（BrdU或EdU）掺入复制DNA中，对遗传性永久染料（CFSE）的子代追踪以及与增殖有关的抗原的表达（Ki67，PCNA ）。

5、凋亡分析
凋亡或程序性细胞死亡是在免疫学和其他研究领域中经常检查的现象。它是免疫系统去除细胞维持体内平衡而不触发炎症反应的重要机制。这与坏死相反，坏死是一种细胞死亡，会触发炎症反应。

凋亡是免疫反应后克隆扩增的T细胞、自身反应的靶向T细胞，自身反应性B细胞以及免疫系统中其他多种自身反应细胞死亡的机制。

通过流式细胞术检测凋亡，有多种靶标可以用，例如，通过Annexin V染色检测磷脂酰丝氨酸外翻，DNA的核酸内切酶消化后通过TUNEL（TdT dUTP Nick End Labeling）法检测末端断裂，检测Caspases的活化，检测线粒体凋亡等等。

检测线粒体膜电位的染料，常用的有JC-1或JC-10。此外，在凋亡过程中，线粒体膜上可表达APO2.7，有现成的抗体可以检测到。

6、荧光蛋白分析
荧光蛋白（GFP，mCherry，YFP，mRuby等）用作蛋白表达的标记。 通常，用含有启动子序列并编码目的基因以及荧光蛋白的质粒转染细胞。 荧光蛋白的表达被用作目的基因表达的指示剂。 最近，还开始用于检测RNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质之间的相互作用（Han et al., 2014）。

荧光蛋白分析技术可用于多种应用，例如体内跟踪移植细胞、细菌或病毒感染以及细胞中的基因敲除，以进一步阐明基因功能。

7、细胞周期分析
细胞周期分析测定包括用饱和量的DNA结合染料对DNA染色。 在大多数情况下，将细胞用70％的乙醇溶液固定，使细胞破膜，然后用染料（PI，7AAD，DAPI）染色。

有些染料可以进入活细胞标记DNA而不会损害细胞，例如Hoescht33342。

在这种类型的分析中，样品以线性坐标、低流速采集，然后使用倍体建模软件（如Modfit等）进行分析，确定细胞周期阶段。

8、信号转导流式检测
此应用使用针对静止和磷酸化信号分子的抗体，并搭配专用缓冲液，可以研究混合细胞群中的信号传导途径，了解信号分子磷酸化变化。

9、RNA流式检测
RNA流式检测是将流式技术与荧光原位杂交（FISH）相结合，可检测RNA表达和蛋白质表达。 这项技术需要对染色方案进行优化，因为并非所有结合了荧光素的抗体都能在40°C的温度下耐受1小时的多次培养。

当没有用于蛋白质靶标检测的抗体时，可以使用RNA流式检测替代。

10、细胞分选
细胞分选利用具有细胞分选功能的流式细胞仪来分离和纯化细胞或颗粒，以进行进一步分析。 本质上，任何可以使荧光的细胞或颗粒都可以通过细胞分选仪进行分离。 可以将细胞分选到96或384孔板、试管和载玻片。 几种常见类型的样品是表达荧光蛋白的转染细胞、干细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤细胞和白细胞群体。

11、绝对细胞计数
绝对细胞计数是将已知浓度的荧光微球，加入到样本中一起采集，通过已知数量的微球和感兴趣的细胞数之比，从而计算出每ml或每ul内细胞数量。

12、定量流式细胞仪
定量流式细胞术使用基于标准微球生成已知荧光分子数的染色曲线，然后使用相同的仪器设置采集细胞，并使用线性回归分析来计算细胞上的荧光分子数量。

取决于所使用的微球，结果可以表示为每个细胞结合抗体数（ABC）、抗体结合能力（ABC）或等效可溶性荧光染料（MESF）分子。

对于这种应用，最好的荧光染料是PE，PE分子几乎总是以1：1的荧光染料与蛋白质的比率结合到抗体上。

13、多重微球阵列测定
多重微球阵列测定采用一系列抗特定可溶性蛋白质或核酸抗体包被的微球，每个微球具有已知量的荧光和特定的靶标，该靶标给出了微球在阵列中的位置。

将微球（目前有100种左右）与目标样品孵育，接着与荧光报告分子孵育，然后在流式细胞仪上用至少2个激光器进行采集，以检测2种不同的荧光染料。 以专用软件根据荧光计算分析物定量结果。

14、吞噬作用测定
使用荧光标记的生物颗粒或细菌，流式就能检测吞噬作用。 细菌用pH敏感染料标记，该染料仅在暴露于较低pH的吞噬体时才发出荧光，表明细菌被吞噬了。

15、小颗粒分析与分选
使用灵敏度更高的流式细胞仪，可以检测和分选外泌体和其他亚微米颗粒。

细胞外泌体，病毒和其他亚细胞颗粒的分析在癌症生物学、癌症治疗和疫苗开发等多个领域创造了新的应用。 这项技术仍处于发展阶段，但是技术和仪器正在迅速改进，在不久的将来会更易于使用。

文献来源：Current Protocols in Immunology，Chapter 5.1.4, Flow Cytometry: An Overview

immunology1988

持续学习中，谢谢老师的归纳总结!