做磷酸化蛋白流式，其实很容易，但需注意条件探索

niwanmao

多聚甲醛固定后，分别以50%甲醇或80%甲醇冰上孵育10分钟破膜，即可检测到磷酸化蛋白，但是两种浓度各有优缺点，50%的甲醇适合p-ERK和p-S6，而80%甲醇适合p-STAT5检测。



由于有时候我们还需要表面标记来区分不同的细胞亚群，所以就需要考虑到对表面抗原的影响，那么50%和80%的甲醇哪种更好呢？看下图，很明显，50%甲醇对CD14的荧光强度影响最小（上行是50%甲醇，下行是80%甲醇，左侧均为不加甲醇的对照）



综上所述，多聚甲醛搭配甲醇，就能够帮助我们方便地检测磷酸化蛋白，但是对于不同的靶标，我们还是需要做好不同浓度的探索，找出对结果影响最小的浓度。

图片来源：Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019;49(10):1457–1973. doi:10.1002/eji.201970107

Veblen

so useful， so appreciated for learning phosphorylation detection by FACS.

249660515

倪老师，我检测细胞pSTAT5，用4% PFA固定细胞后（室温15min），再加入预冷的90%甲醇破膜，发现细胞全都不见了。本来固定完都还能看到白色半透明沉淀，加了甲醇就没有细胞了，上机也是检测不到细胞。请问可能是哪里的问题啊，在这个地方困扰很久了

niwanmao

249660515 发表于 2024-9-27 14:52
倪老师，我检测细胞pSTAT5，用4% PFA固定细胞后（室温15min），再加入预冷的90%甲醇破膜，发现细胞全都不见 ...

不是80%甲醇吗

249660515

niwanmao 发表于 2024-9-27 15:15
不是80%甲醇吗

https://www.cellsignal.cn/learn- ... ol-permeabilization
倪老师，我是按照cst推荐的protocol做的，他里面用的90%。后面我再试试80%看，就是差的这10%会有这么大影响吗

niwanmao

249660515 发表于 2024-9-28 11:54
https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-flow-methanol-permeabilization
倪老 ...

有时候可能会，可试试看

249660515

niwanmao 发表于 2024-9-28 16:14
有时候可能会，可试试看

好的，谢谢倪老师