如何判断门中框定的是细胞还是碎片？

steven

大家好，好久没有做流式了，所以也没怎么来逛论坛，前两天做一个新的实验遇见一些问题，想让大家提点建议。
这次做的是从小鼠肝脏中提取星形细胞（HSC）。之前做过大鼠的，基本原理就是通过低FSC，高SSC划门，然后进一步用375nm或者405nm激发HSC的自发荧光进行分选。虽然细胞的得率比较低，但是一直进行的还比较顺利。这次要分选小鼠的HSC，参考文献，方式和流程和分选大鼠HSC几乎是一样的，所以就按照自己以往的流程开始分选，结果出了大问题。
如图一所示，划门的策略就是先圈定细胞位置（可能是小鼠细胞量太少了，没出现低FSC，高SSC的群，所以就先全选上了，P1之外大概有5%的细胞，我一般认为是粘连的细胞，不知道对不对，暂且是没划进去），之后7AAD选活细胞，然后FSC-A/H祛除一下双联体细胞，最后把自发荧光高的位置圈出来分选（大概2%）。最后分选出17W的细胞，但是，离心之后一个细胞也没有。。。（确认收集到了液体，总量增加了1ml。离心之前，我在灯光下照着看了一下收集细胞的离心管，里面很透明，不像每次收集到细胞之后有浑浊的颗粒感，就觉得不对，结果离心之后真的啥都没有）。因为这种情况之前出现过一次，所以考虑是不是机器没有设置好，分选的液滴里没有细胞，所以就又做了一次。
第二次为了增加细胞的总量，把2个小鼠的肝脏一起提取细胞。按照上述策略又分选了一次。
如图二所示，这次自发荧光的分群更不明显了，尽量的划了荧光高的细胞分选，大概选了10w之后我觉得不放心，观察了一下收集管，虽说液体量增加了，但是依旧很透明，不像有细胞的样子。当时没有办法了，也别啥活细胞死细胞了，直接划了自发荧光高的区域重新分选（P5），结果这次分选后，收集到了细胞（总之有细胞，暂且不管是真的自发荧光，还是死细胞的自发荧光，还是双联体造成的荧光加倍）。而且反过来一看P5（绿色）在FSC-SSC图上的位置，就是被我认为是粘连细胞的区域，所以我在考虑是不是我之前一直在非细胞区域分选，所以没有细胞。有一些想法我说一下，大家看看给些建议。
1.机器是ARIA-3，第一次分选用了1.0的滤片，第二次分选因为不太容易圈门，换成了2.0的（之前分选大鼠细胞时一直是2.0）。提供了一张提大鼠细胞时的图，可以看到虽然数量少，但是会有低FSC，高SSC的细胞群出现，当时FSC大概在180左右，这次小鼠的有240，会不会是FSC调高了，把碎片的图像扩大了，导致细胞跑到右上角去了？实际上这次框定了成群细胞实际上是被放大了碎片群？这样想的理由还有一个，因为是从组织提取细胞，所以碎片自然也会很多，流式之前离心收集细胞的时候大概15ml离心管的底部尖那个位置都是白色的沉淀，但是重新悬浊之后发现其中细胞并不多，或者说很少，都是很密集的碎片。以细胞为样本做流式的时候，细胞碎片应该很小，小于细胞尺寸，位于最左下角，但是从组织提取细胞的时候，组织的碎片会不会和细胞尺寸差不多，从而被误当细胞啊（特别是HSC是很小的一种细胞）？再提供一张文献中的图，看细胞和碎片的位置，觉得就像是我的图调低FSC/SSC之后的图。。当然文献中的图目标细胞量很多，可能是因为他用的是40w+肝纤维化诱导之后的小鼠肝，星形细胞的含量高，而我用的是6w的野生型小鼠，细胞比例太低了造成的。
2.还有就是7AAD的图，第二次分选的时候出现了2群细胞，所以我就选定荧光低的那一组为活细胞（这次偷懒了，没有做无7AAD染色的对照组），后来我圈定了7AAD高信号的那部分细胞，发现很大一部分就是FSC-SSC图中的绿色细胞。所以这一部分7AAD高信号的细胞会不会不是死细胞，只不过是碎片和细胞两种物质在7AAD图上自发地分成了2群啊。（之前好像也出现过用无7AAD染色的对照组划阴性门的时候，加7AAD之后，阴性门内的细胞像这次一样分成2群，阳性的还有一部分，当时没在意，现在想想是不是碎片和细胞在7AAD通道基础荧光就不一样，当碎片太多的时候，就会分成2群啊？）
3. 一会去看看分出来的细胞怎么样了，不知道大家遇到过这样的问题没有，我也是第一次遇见，想了好久，觉得有可能是碎片量大于细胞量造成了这个局面（原来做大鼠的时候虽然碎片也很多，但是大鼠肝脏大，细胞多，估计数量的绝对值还是超过碎片的），不知道大家怎么看。
4. 还有一点挺奇怪的，如果说碎片的数量很多，大小接近细胞，那么分选之后的液体里应该有碎片可以看到啊，为啥离心之后啥都没有（400xg 10min）。。。而做流式之前收集细胞时离心后可见大量的碎片（同样400xg 10min），说明这个离心的条件碎片也能沉淀啊，怎么分选后啥都没有呢。。。

niwanmao

steven 发表于 2020-4-20 08:31
本来以为是因为酶用多了细胞都死掉了，但是今天看了一下分选后的细胞，零星的长起来了（在帖子里加了一张 ...

因为所谓的碎片区域，并不是绝对的，因为FSC并不能绝对区分细胞大小，你平时做其它样本也可以发现，淋巴细胞区域和碎片区域是部分重叠的。
这说明，分选的时候，还是有少数细胞被你分到了。

PS：回帖插入图片很简单，点击回复后跳出的框是简单的回复，不能直接插入图片，可点击编辑框右上的“高级模式”，就可以上传了。

niwanmao

问题会不会在解离成单细胞的过程上？

steven

niwanmao 发表于 2020-4-16 14:10
问题会不会在解离成单细胞的过程上？

我确认一下，和分离大鼠的方案相同，也许酶什么的过量了？

niwanmao

steven 发表于 2020-4-17 08:21
我确认一下，和分离大鼠的方案相同，也许酶什么的过量了？

解离单细胞的时候，进行了研磨吗？

steven

niwanmao 发表于 2020-4-16 14:10
问题会不会在解离成单细胞的过程上？

可能是胶原酶用多了，大鼠的100U/ml，小鼠的话文献给到0.1U/ml-0.75U/ml。。。。按照胶原酶的常规用量大概在200U/ml，不知道小鼠的为什么这么低。。。
倪老师，虽然下次打算降低酶的浓度试一下，但是这次流式中出现的这几个问题你可以帮忙解释一下吗？

steven

niwanmao 发表于 2020-4-17 08:40
解离单细胞的时候，进行了研磨吗？

没有研磨，就是把被膜撕开震荡到缓冲液中。

niwanmao

steven 发表于 2020-4-17 09:42
可能是胶原酶用多了，大鼠的100U/ml，小鼠的话文献给到0.1U/ml-0.75U/ml。。。。按照胶原酶的常规用量大 ...

我觉得关键还是在细胞上，所以才问你这些问题。
只要细胞解离的好，细胞没碎掉 ，就会好的。

steven

niwanmao 发表于 2020-4-17 13:23
我觉得关键还是在细胞上，所以才问你这些问题。
只要细胞解离的好，细胞没碎掉 ，就会好的。 ...

本来以为是因为酶用多了细胞都死掉了，但是今天看了一下分选后的细胞，零星的长起来了（在帖子里加了一张图，回复中不会插图啊），看起来分选的策略应该没有太大问题，再优化一下单离细胞的方案，估计会更好一些。
这是不是说明第一次没选出来细胞，是因为划门的区域确实是碎片啊。组织由来的碎片可能尺寸大到和细胞一个级别吗？

steven

niwanmao 发表于 2020-4-20 08:50
因为所谓的碎片区域，并不是绝对的，因为FSC并不能绝对区分细胞大小，你平时做其它样本也可以发现，淋巴 ...

谢谢倪老师，这回明白了，看来还是要不同的实验经过多次测试才能调好最佳的实验参数。