找回密码
 加入流式中文网

QQ登录

只需一步,快速开始

查看: 703|回复: 6

通过体内流式细胞术对血液中的细菌进行定量

  [复制链接]
发表于 2020-4-27 16:06:23 | 显示全部楼层 |阅读模式

亲爱的FLOWER,加入流式中文网,一起讨论,一起学习,享受更多福利吧!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有账号?加入流式中文网

×
菌血症每年发病率约200例/10万人,死亡率高达40%,这对现代卫生保健系统构成了重大挑战,对患者的负担日益增加,尤其是医院获得性(医院内)感染的多药耐药菌株(如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)或耐卡巴培南的肺炎克雷伯菌)。然而,菌血症本身并不是每天由于进食或刷牙而从口腔进入血液的良性微生物引起的,所以为了了解生理性和病理性菌血症之间的差异,改善诊断和治疗工具,需要新颖的方法来实时监测菌血症水平。
在临床中,由于血液中细菌浓度低,即使在部分急性败血症(<1,000个菌落形成单位/ ml)时也是如此,所以目前一般通过经典血液培养来诊断血液感染,然后通过质谱或PCR来鉴定传染源。尽管后两种方法极大地加速了物种识别过程,但血液培养的阳性时间仍相当长(革兰氏阴性细菌为12–24 h,革兰氏阳性细菌为24–48 h),无法实现实时分析。关于动物细菌从血液中清除的定量研究,也都是通过平板或放射法,使用集落形成单位(CFU)测定定量评估,但两者都需要抽血,因此也无法进行实时监测。最近有两项研究采用流式细胞术和细胞分选来加速血液中细菌的检测和抗生素敏感性测试:Huang等人[1]建立了一种方法,该方法基于溶血、有/无抗生素的短期细菌培养以及检测抗生素诱导前后细菌前向和侧向散射光为基础,从而在5 h内提供血液细菌感染的抗生素检测结果。 Yoon及其同事[2]设计了一种微流控芯片,该芯片可通过介电泳力将细菌与血液分离,从而进行下游分析。尽管取得了这些进展,但无标记、不依赖培养和采血、可用于实时监测血液感染的体内方法仍然有待完善。
弗拉基米尔·扎洛夫(Vladimir Zharov)的实验室在体内流式细胞仪领域做出了开创性的贡献[3],此外还开发了检测血液、淋巴系统和脑脊液中罕见循环肿瘤细胞、血凝块和疟疾寄生虫的方法,分析主要基于光声和光热效应,但也基于常规的荧光流式细胞术。 有些涉及通过抗体偶联的纳米颗粒进行靶向标记,而另一些则完全没有标记。 有趣的是,体内流式细胞术甚至可以用于通过光热效应杀死靶细胞。
在2012年,Zharov及其同事已经通过体内流式细胞术建立了细菌的检测和杀死方法。利用类胡萝卜素介导的462 nm和741 nm的光吸收,他们将金黄色葡萄球菌注射到小鼠的耳朵里后,能够通过体外和体内的光声测量来检测细菌。然而,在血液中,大量的红细胞会产生高水平的背景噪声,这对通过流式细胞仪检测细菌构成挑战,同时也影响了金黄色葡萄球菌的无标记检测。作者通过使用金纳米颗粒与金黄色葡萄球菌特异性抗体偶联来增强光声和光热效应,以及磁性纳米颗粒将细菌保留在检测部位更长的时间,从而解决了这个问题。通过这些措施,他们不仅能够检测到1毫升血液内0.5 CFU的金黄色葡萄球菌,而且还可以在体内杀死细菌。虽然这项技术意味着在体内实时监测细菌方面的重大进步,但要在不注入任何外源试剂(例如纳米粒子)的情况下检测血液中的细菌仍然是一项挑战。
最近,Zharov及其同事提出了一种新颖的基于荧光的非侵入性体内流式细胞术方法,无需注射任何检测试剂即可检测感染小鼠血液中表达绿色荧光蛋白(GFP)的细菌。 他们比较了革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌在小鼠血液中的清除率,这两种细菌被归为ESKAPE病原体组(ESKAPE是六种细菌的首字母缩写,这六种细菌由于耐药性和增加临床负担而被认为特别危险:粪肠球菌,金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯菌,鲍曼不动杆菌,铜绿假单胞菌和肠杆菌属)。

11.png
如图1所示,通过将激光束聚焦在小鼠耳朵的小毛细血管上来检测细菌,并激发由细菌表达的GFP,然后用光电倍增管(PMT)检测信号。从这些原始荧光数据中,它们每次得出一个峰值计数,该峰值与血液中细菌的浓度成正比。当根据当前的金标准验证其方法(在琼脂平板上划线后取血并计数菌落)时,他们证实这两种方法均显示出高度相似的细菌清除率。

这项新技术揭示的主要生物学发现是,所研究的两种细菌遵循不同的清除模式:铜绿假单胞菌(革兰氏阴性菌)的清除呈单相性,在对数坐标上斜率固定,在50至60分钟后,注射的1×10E7个CFU消失了。相比之下,金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)则遵循双相清除模式,在最初的10–20分钟内,约99%细菌被清除掉,随后是一个缓慢得多的清除阶段,持续超过注射后60分钟。使用这种实时监测方法来进一步研究清除革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌有关的生物学机制将是令人兴奋的。例如,观察到的金黄色葡萄球菌的两阶段清除使人想起以前研究中描述的“快速清除”和“缓慢清除”机制。尽管大多数细菌细胞被肝脏中的Kupffer细胞从血流中清除,但有些细菌可通过补体调理和结合血小板,保护其免受这种“快速清除”的影响,而进入“慢清除”,使得其在脾脏中可诱导适应性免疫。有趣的是,革兰氏阳性细菌(如金黄色葡萄球菌)可被Kupffer细胞的补体受体识别,革兰氏阴性细菌不能被补体受体识别,但很可能被清道夫受体结合,这为革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌的清除动力学不一致提供了一种可能的解释。细菌清除的另一个重要机制是血液中的红细胞具有直接的杀菌活性,这些红细胞通过电荷结合细菌并通过氧化作用将其杀死。
未来,细菌血液清除机制的研究将极大地受益于无创实时监测方法。虽然在实验室环境中,使用表达GFP的细菌通常是可行的,但该方法仅在完全无标签的情况下才具有临床诊断价值,也就是说,对于不表达荧光报告蛋白的细菌,通过检测细菌蛋白质的特定(自发)荧光特征实现检测,这对于实时监测抗生素治疗后的有效率特别有用。
基于细菌核苷酸含量和光散射特性的高分辨率流式细胞仪可区分小鼠肠道菌群中的细菌种群。通过此技术获得的细胞学“指纹”在健康小鼠和显性小鼠之间显著不同。也有证据表明,肠道菌群的细胞指纹可以预测克罗恩病。此外,肠道菌群的流式细胞术证明,在克罗恩病期间,肠道菌群不仅相对丰度变了,而且细菌种群数也发生了变化,每克粪便中的绝对细菌浓度发生了变化。尽管微生物群领域目前仍由下一代测序技术控制,但在绝对细菌浓度、细菌活力、适应性、抗体包被等参数上,流式细胞术是极其有优势的。
总之,宿主相关微生物研究方面,流式细胞术是一种功能强大的工具,可用于对健康人和患者样本进行单细胞分析。 随着仪器变得越来越敏感,针对细菌生理学的新型探针的出现,将有前所未有的机会在单细胞水平和多参数空间中研究宿主-微生物的共存关系以及宿主-病原体的相互作用。 在这种情况下,Harrington等。 将细菌的流式细胞术提升到另一个水平,从而不仅可以在体内和实时进行检测,而且可以在背景噪声颗粒(血液)浓度很高的环境中进行检测。 他们的工作将为今后解决菌血症的细胞和分子机制研究带来变革。
设想一下,如果体内流式无标记监控血流菌群做成熟了,能够通过人工智能利用“细胞学指纹”把不同菌种也能区分开,或许,到时候真的就可以把琼脂板扔到垃圾桶吧!


参考文献:
[1] Huang T‐H, Tzeng Y‐L, Dickson RM. FAST: Rapid determinations of antibiotic susceptibility phenotypes using label‐free cytometry. Cytometry 2018;93A:639–648.
[2] Yoon T, Moon HS, Song JW, Hyun KA, Jung HI. Automatically controlled microfluidic system for continuous separation of rare bacteria from blood. Cytometry 2019A;95:1135–1144.
[3] Cai C, Carey KA, Nedosekin DA, Menyaev YA, Sarimollaoglu M, Galanzha EI, Stumhofer JS, Zharov VP. In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis. Cytometry 2016;89A:531–542.
[4] Zimmermann J. Trash Your Agar Plates! Blood Stream Bacteria Are Now Quantified by in vivo Flow Cytometry [published online ahead of print, 2020 Apr 15]. Cytometry A. 2020;10.1002/cyto.a.24010. doi:10.1002/cyto.a.24010
[5]Harrington WN, Nolan J, Nedosekin DA, Smeltzer MS, Zharov VP. Real-Time Monitoring of Bacteria Clearance From Blood in a Murine Model [published online ahead of print, 2019 Nov 26]. Cytometry A. 2019;10.1002/cyto.a.23925. doi:10.1002/cyto.a.23925
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2020-5-1 17:23:03 | 显示全部楼层
老师,不好意思我没有看完,是不是血流相当于流体,然后激光检测带GFP的细菌就行了。
那这样的话,岂不是细菌得带荧光才可以检测。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
 楼主| 发表于 2020-5-2 10:57:17 | 显示全部楼层
Veblen 发表于 2020-5-1 17:23
老师,不好意思我没有看完,是不是血流相当于流体,然后激光检测带GFP的细菌就行了。
那这样的话,岂不是细 ...

目前大多数研究是基于GFP,但以后实际应用,肯定是要做到只通过细胞大小/形态等物理特征,结合自发荧光,实现鉴别。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2020-5-2 13:07:54 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-5-2 10:57
目前大多数研究是基于GFP,但以后实际应用,肯定是要做到只通过细胞大小/形态等物理特征,结合自发荧光, ...

Got it, thank Mr. Ni.
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2020-5-4 14:53:18 | 显示全部楼层
比当年那个有创测外周血的EVs的感觉有意思多了,或许未来会有量子化的无创流式设备或者芯片,更高速且有效,当然不是安捷伦的那个
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2020-5-4 16:58:37 | 显示全部楼层
facetodog 发表于 2020-5-4 14:53
比当年那个有创测外周血的EVs的感觉有意思多了,或许未来会有量子化的无创流式设备或者芯片,更高速且有效 ...

敢想,敢做,就都有可能:)
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2020-5-5 19:22:31 来自手机 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-5-4 16:58
敢想,敢做,就都有可能:)

人类总会有更好的解决办法
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2|浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2024-3-28 22:30

Powered by Discuz! X3.5

© 2001-2024 Discuz! Team.

快速回复 返回顶部 返回列表