【求助，3颗流星】强荧光染料调节2色补偿的问题

cocoa

问题一：
我的细胞中药物是PE荧光，FITC是染料荧光，这种情况下，荧光是极强的（相对于抗体染料）。
单染管如FITC单染管，图1，2，没办法区分阳性群和阴性群，该怎么用flowjo调补偿？
我试了下用什么都不染的阴性管圈阴性群（图3），但是没有明显补偿效果不知道为什么？
问题二：
只有 阳性细胞群中位数＝阴性细胞群中位数 才是正确的补偿，flowjo在调补偿时没有显示中位数，是需要自己在面板上加上这个数值然后判断是否调整到位吗？如图4

niwanmao

1、如果阴性和阳性分不开，不建议用来调节补偿。PE你这里可以用未加药的细胞+加药的细胞调节PE漏到FITC的荧光，而要调节FITC漏到PE 的补偿，需要你用该种细胞阳性标记的FITC抗体来调节。
2、FlowJo调补偿，是有点繁琐，看中位数，我印象中窗口下方的Statisticstatistics下面可以添加的。

cocoa

niwanmao 发表于 2020-5-5 20:50
1、如果阴性和阳性分不开，不建议用来调节补偿。PE你这里可以用未加药的细胞+加药的细胞调节PE漏到FITC的荧 ...

谢谢老师的回复，有一点不太理解的地方，就是我的FITC其实就是CFSE染料的荧光，并不是抗体，如果找FITC抗体的话，是只要是FITC标记的抗体都可以吗？还有就是刚才我按照您说的调节了一下，如图，不知道这样的补偿值可以用吗？

niwanmao

cocoa 发表于 2020-5-5 22:21
谢谢老师的回复，有一点不太理解的地方，就是我的FITC其实就是CFSE染料的荧光，并不是抗体，如果找FITC抗 ...

CFSE就更简单了，用CFSE标记细胞是肯定阳性的，你就拿你们标记好CFSE的细胞和未标记的细胞混合，不就有明显的阳性群和阴性群了？

cocoa

niwanmao 发表于 2020-5-6 08:15
CFSE就更简单了，用CFSE标记细胞是肯定阳性的，你就拿你们标记好CFSE的细胞和未标记的细胞混合，不就有明 ...

我可不可以理解为，把阴性管的细胞和单染CFSE管的细胞混合就可以啦？那为啥不能直接用阴性管作为阴性群调补偿吖？

cocoa

niwanmao 发表于 2020-5-6 08:15
CFSE就更简单了，用CFSE标记细胞是肯定阳性的，你就拿你们标记好CFSE的细胞和未标记的细胞混合，不就有明 ...

还有就是，我最后评论的那个图FITC的阴性群荧光强度到了-600了，才达到了横平竖直的效果，不知道这样的负值太大的补偿可以用吗~~

niwanmao

cocoa 发表于 2020-5-6 08:25
我可不可以理解为，把阴性管的细胞和单染CFSE管的细胞混合就可以啦？那为啥不能直接用阴性管作为阴性群调 ...

只有混在一起，形成阳性群和阴性群都有，并且分开的情况，才是调节补偿的正确之道。
两管分开，获取的条件还是有差异的，而且无法使用自动补偿功能。

先按照上面所说的做完再说，你目前的这些数字都是不能反映真实情况的。

cocoa

niwanmao 发表于 2020-5-6 08:39
只有混在一起，形成阳性群和阴性群都有，并且分开的情况，才是调节补偿的正确之道。
两管分开，获取的条 ...

好的，谢谢倪老师的耐心回复