分选效率问题

wwwtangya

不知道大家用BD Aria 3分选的时候的实测细胞数和仪器记录数相差大么，之前分细胞的时候，仪器显示2万，实际细胞数只有1万，大概50%；但最近有人死细胞染DAPI分细胞核，分到50万，实测只有5万左右，相差很大，忘记回测纯度了，但是分选小球回测纯度96%以上，纯度应该没问题，流速也不高，3左右，2000evnt/s ;想请教是什么原因，该怎么改善。

niwanmao

分选我没实际做过，从理论上推测，会不会有可能分选出的细胞喷到管壁上导致细胞死亡。

wwwtangya

niwanmao 发表于 2020-5-30 18:12
分选我没实际做过，从理论上推测，会不会有可能分选出的细胞喷到管壁上导致细胞死亡。 ...

倪老师，因为他们本来就是死细胞，所以不存在这种情况

niwanmao

wwwtangya 发表于 2020-5-30 19:02
倪老师，因为他们本来就是死细胞，所以不存在这种情况

哦，我只注意你这里说的前半段50%纯度那事儿了。

后面DAPI分细胞核的话，由于细胞核小，会不会与处理时的一些碎片啥的信号分不开，所以这个50万的信号里面，真正细胞核的信号应该不多？
这就跟我们平时做分析时也一样，如果圈淋巴细胞，而红细胞裂解不干净的时候，会发现虽然淋巴细胞区域取了1万个细胞，但实际上可能只有1000个是真的淋巴细胞。
你这里虽然仪器显示分选到了50万个细胞核，但实际上这个区域可能很多信号是碎片或其它非细胞核信号，那么就很可能造成这种现象。
仅为推测，供参考。

xcl881028

一般我在仪器调试完成后会用微球实测一下分选100微球在镜下看看微球实际数量，如果太少或者没有的话可能调试参数不好，需要重新调（实际在80-90%就差不多了）；分选细胞的时候不太放心的话也可以分选特定数量的细胞在镜下看看细胞数量、状态是不是对的。

sunzheng_99

分选

家的感觉

分选模式会影响实际获得的细胞数，得率相对损失细胞少一些。我感觉你说的流速是3也不高，就是2000evnts/s有些高，可以适当稀释样本。还有就是分选后回收的细胞从仪器拿下来后离心损失的多。
之前我们遇到过一个情况，分选时仪器上面显示的很多，最后离心计数相差很远很远，最后发现离心用的15ml离心管装的体积变大，同样的离心力（离心速度）与离心时间，沉淀的细胞量减少，把离心力增大后，计数得到的细胞和仪器显示的明显接近。所以，仪器调试、样本情况、分选参数设置、分选后离心等都会影响。

wwwtangya

niwanmao 发表于 2020-5-31 17:44
哦，我只注意你这里说的前半段50%纯度那事儿了。

后面DAPI分细胞核的话，由于细胞核小，会不会与处理时 ...

谢谢倪老师，应该是这个原因，今天分选了细胞验证了一下，细胞数有70%，是正常的。

wwwtangya

xcl881028 发表于 2020-6-1 09:41
一般我在仪器调试完成后会用微球实测一下分选100微球在镜下看看微球实际数量，如果太少或者没有的话可能调 ...

十分感谢！分微球确实是一个很好的验证方式。

wwwtangya

sunzheng_99 发表于 2020-6-1 09:41
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MjAwOTd8NTRhZmQ5MmV8MTc0MjI0ODgzN3wwfA%3D%3D

谢谢