如何用流式细胞术增进我们对结核分枝杆菌感染机制理解

niwanmao

结核病（TB）及其致病菌结核分枝杆菌，人类仍然知之甚少，而且这种流行病仍然很严重。据估计，2018年有1000万新的结核病病例，约有50万新的耐药结核病例。这些数据说明了我们对新型或改良的结核病药物的需求强烈。为了实现这一目标，必须充分了解结核分枝杆菌感染引起结核病的整个生理过程。

结核分枝杆菌感染可导致一系列疾病结果（下图）。当结核分枝杆菌进入肺中之后，肺泡巨噬细胞吞噬细菌，无论有无可见的肺部病变，感染均会继续进行。在90％至95％的健康个体中，感染可能会潜伏数十年，并且有可能重新激活。在此期间，被感染的巨噬细胞引发炎症反应，募集先天免疫细胞以将感染控制在肉芽肿中。诱导适应性免疫后，巨噬细胞分化成专门的细胞，例如多核巨细胞和泡沫巨噬细胞，并被B细胞和T细胞包围。感染可以通过宿主免疫反应或药物治疗清除，也可以持续并保持稳定的静止状态（大部分细菌都呈现活动性复制状态，并容易受到免疫反应和抗生素治疗的影响）。结核分枝杆菌可能会因对药物治疗的依从性差或耐药菌株感染而导致耐药。导致细菌异质性的其他因素包括生长速率、分裂对称性、代谢速率、蛋白质分布和基因表达的变化。然而，免疫细胞坏死性破坏的增加导致酪蛋白的形成。随着感染的进行，这可能导致肉芽肿的空化，肉芽肿可能塌陷到肺中，从而将细菌释放到气道中。


此外，人们越来越认识到分枝杆菌表现出不同的生理和代谢状态。推进我们对这些不同细菌状态的理解是许多基础结核病研究的重点。流式细胞仪是一个强大的工具，在理解结核分枝杆菌种群的生理和代谢方面有着巨大的应用潜力。

宿主环境如何影响分枝杆菌的生理状态？
结核分枝杆菌在宿主感染后位于何处？
结核感染的宿主和病原体之间的最早接触发生在结核分枝杆菌和肺中的先天免疫细胞之间，主要是巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和中性粒细胞。 这些免疫细胞容易吞噬结核分枝杆菌，并且是抵抗病原体的最早防御者。 但是，关于究竟最初感染了哪些细胞以及哪些药物可以从肺泡传播到肺间质的信息仍然相对不清楚。 最近的一项研究利用鼠类感染模型的流式检测证明，表达mCherry的结核分枝杆菌的早期感染几乎仅发生在气道驻留肺泡巨噬细胞中。 这些受感染的巨噬细胞通过需要致病性相关的ESX-1分泌系统的机制传播到肺间质，突出了宿主细胞和结核分枝杆菌之间的动态相互作用。

巨噬细胞通过包括吞噬体融合、细胞因子分泌、细胞凋亡和自噬在内的多种策略消除结核分枝杆菌。成像流式细胞术已证明在探测宿主-病原体相互作用，定量分析吞噬作用、吞噬体酸化和细胞内细菌复制方面极为有益。巨噬细胞对结核分枝杆菌的识别导致吞噬作用和细菌在吞噬体中的隔离，吞噬体通常通过与溶酶体融合并随后酸化含有病原体的吞噬体消灭病原体。但是，结核分枝杆菌利用多种策略通过抑制吞噬体成熟和吞噬体的产生来维持慢性感染，从而在吞噬体中生存和复制。结核分枝杆菌对巨噬细胞吞噬体中的生理适应是其发病、传播和持续生存的重要机制。在无症状感染期间，分枝杆菌能够持续数十年的能力提出了有关其复制和代谢状态的疑问。有些研究支持这些细菌可能处于非复制性，代谢失活状态，而另有些研究则支持这些分枝杆菌是非复制性且具有代谢活性，但包含在动态宿主免疫系统中。这些特定亚群的研究通常由于细菌数量低以及难以在肉汤或琼脂上培养而受到阻碍，流式细胞术提供了研究这些种群而无需进行预培养或大量培养的理想工具。

分枝杆菌生理受到宿主Niche的影响吗？
结核分枝杆菌的主要宿主环境是巨噬细胞。最近的研究表明，结核分枝杆菌如何适应巨噬细胞内的生活，在该环境中会遇到亚硝化、氧化、低氧和营养不良等应激。与核苷酸类似的蛋白NapM是结核分枝杆菌中一种广泛的应激诱导蛋白，可以被多种应激信号诱导。最近发现，NapM可保护结核分枝杆菌免受压力介导的杀伤，因为它可通过抑制分枝杆菌DNA合成来增强巨噬细胞中的结核分枝杆菌生存。流式细胞术用于通过DAPI染色测量每个细胞的DNA含量，这表明NapM影响了体内DNA的复制。一种保守的结核分枝杆菌跨膜蛋白Rv0426c（P96272），以前被证明对结核分枝杆菌在巨噬细胞中的生存至关重要，在营养饥饿的情况下被上调，是一种毒力因子，能抑制细胞凋亡，使分枝杆菌在巨噬细胞内复制。

为了使结核分枝杆菌维持巨噬细胞和肉芽肿中的感染（如下所述），它需要脂肪酸的输入和代谢。但是，这些过程所需的机制了解甚少。基于流式分选（FACS）的方法筛选了用脂肪酸底物BODIPY-棕榈酸代谢标记的表达mCherry的结核分枝杆菌突变体，鉴定了几个结核分枝杆菌基因（rv2799，rv0966c，rv0655，和rv0200）在巨噬细胞感染期间需要结合BODIPY。此外，在此过程中确立了脂肪酸转运蛋白Mce1和Rv3723 / LucA的作用。最近的另一项研究表明，与未感染的巨噬细胞相比，结核分枝杆菌感染的巨噬细胞显示出富含甘油三酸酯的脂质液滴的积累增加。成像流式细胞术可对用BODIPY 493/503和mCherry表达-M染色的脂质液滴共定位。脂质的积累随后导致泡沫巨噬细胞的发育，这表明与吞噬作用降低和呼吸爆发有关的宿主反应受损。有些研究表明，脂质代谢有助于持久性，这可能指向使用这些检测方法来增进我们对感染过程中分枝杆菌代谢适应性的了解。

结核分枝杆菌最初与气道巨噬细胞相遇后，被感染的巨噬细胞可能会通过迁移到肺部和其他部位的远端部位而促进分枝杆菌的传播。这些感染的巨噬细胞募集未感染的巨噬细胞和其他淋巴细胞，最终形成肉芽肿。结核性肉芽肿是结核分枝杆菌感染的典型组织结构。肉芽肿由几种免疫细胞组成，包括巨噬细胞、上皮样细胞、多核巨细胞和T淋巴细胞。从形态上讲，这些细胞通常围绕中央坏死核心（酪蛋白）组织，周围被巨噬细胞包围，巨噬细胞被T细胞和B细胞包围，并可能具有外周纤维化边界。肉芽肿表现出很大的异质性，除了经典的干酪样肉芽肿外，肉芽肿还可以是非坏死性，富含中性粒细胞的、矿化的、纤维化的或空化的。它们是隔离结核分枝杆菌的方法，但同时也可能为分枝杆菌提供Niche，使其可以复制和存活。此外，肉芽肿表现出选择性和可变的药物渗透性，这可能会限制针对抗菌药物的功效。重要的是，肉芽肿中的分枝杆菌暴露于异质性细胞环境，不同的氧气水平和炎性环境，这些环境已知会促使结核分枝杆菌进入持续状态。对肉芽肿中结核分枝杆菌的代谢和复制状态了解甚少。但是，据认为这些细菌处于休眠状态。使用流式细胞术检测分枝杆菌肉芽肿的最早研究之一，是针对结核分枝杆菌的近缘基因组亲缘关系以及鱼和青蛙等宿主中结核病的病因的玛氏分枝杆菌，这项工作使用了不同的荧光诱导来鉴定在肉芽肿中诱导的启动子，而不是在巨噬细胞中诱导的启动子，具体而言，通过转录融合至绿色荧光蛋白（GFP）的分枝杆菌启动子能够鉴定在感染的不同阶段表达的肉芽肿特异性基因，包括在持久性过程中激活的选定基因。


宿主细胞表型会改变感染结果吗？
宿主细胞表型可调节结核分枝杆菌感染的结果。使用荧光标记的结核分枝杆菌菌株，该菌株在暴露于特定的宿主应激源后会发生反应并发出荧光，被流式检测到。与间质性巨噬细胞相比，肺泡巨噬细胞显示出更高的细菌负荷，这表明肺泡巨噬细胞更利于细菌入侵和生长。最新的工作支持了这一点，该研究将FACS与双RNA测序结合使用，以提供对不同细菌生长表型与宿主细胞之间相互作用，有趣的是，这些结果表明，肺泡巨噬细胞中结核分枝杆菌的生长增加是由于铁和脂肪酸的获取增加，而间质巨噬细胞中结核分枝杆菌的生长受到铁螯合和一氧化氮水平升高的限制 。

同样，巨噬细胞极化的异质性对结核分枝杆菌感染控制的影响最近已被人类单核细胞衍生的含有活或死分枝杆菌的巨噬细胞的RNA测序所强调。持续表达长寿命mCherry的结核分枝杆菌报道菌株被用作所有细菌的量度，而GFP的诱导型表达可作为细胞活力的代表。将此双重报告基因与FACS分析结合使用，可将含有活菌的巨噬细胞与含有死菌的巨噬细胞分离，用于RNA测序。这些结果表明，参与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）信号转导的基因的表达区分了两个巨噬细胞亚群。 GM-CSF的添加导致分枝杆菌的生长受到抑制，而GM-CSF的阻断则使分枝杆菌的生长受到抑制，这说明了结核分枝杆菌可操纵该关键机制以驱动更有利的宿主环境。

宿主应激源如何影响分枝杆菌的代谢？
细菌的潜在代谢状态是细菌存活的关键决定因素。已观察到响应于持久性、营养物质的可用性、代谢物感知和抗生素压力的响应，中枢代谢途径发生了变化。代谢变化可能表现为活性氧（ROS）水平的改变。不同的ROS传感探针可特异性检测不同种类的ROS，随后可提供有关代谢适应如何影响氧化应激的见解（图2）。


例如，已证明羟苯基荧光素（HPF）仅对过氧化氢染色，而DCFDA（也称为H2DCFDA）可用于一般氧化应激测量（见下表）。

HPF和CM-H2DCFDA最近已在体外结合流式，研究结核分枝杆菌对ROS种类对感染和抗生素治疗的耐受性，提供了有用的工具来分析代谢活动。

最近的一项研究探讨了半胱氨酸和其他小的硫醇（它们作为细胞质的氧化还原缓冲液）在与一线抗结核药物结合使用中的作用。抗结核药物可抑制鼠巨噬细胞中持久性和耐药性结核分枝杆菌的形成。由于霉菌硫醇是半胱氨酸的储存库，因此可以假设半胱氨酸的积累可能是导致INH耐药的因素。出乎意料的是，还原性化合物（例如N-乙酰半胱氨酸或维生素C与INH的组合可提高ROS的产生，并防止耐药性和耐药性菌群的形成，如随后通过流式细胞术评估的用超氧化物指标二氢乙啶染色，这可以提供防止细菌进入持久性状态的方法，这可能对有效治疗结核病具有重要意义。相比之下，通过将氧化还原敏感的GFP（roGFP2）与依赖于硫醇的氧化还原酶（Mrx1）偶联，设计了一种遗传编码的生物传感器（Mrx1- roGFP2），从而为流式细胞术使用提供了一种极为灵敏的比例传感器，能够检测纳摩尔浓度的变化。霉菌硫醇的氧化还原电位。 Mrx1-roGFP2与流式细胞仪结合使用，以评估归因于巨噬细胞诱导的氧化应激和抗生素暴露的霉菌硫醇稳态的扰动。 CellROX可以检测和定量活细胞中的ROS；它是可透过细胞的，处于还原状态的非荧光或弱荧光，并且在氧化时会发出强荧光。多参数染色与针对特定类型ROS的探针相结合，可用于研究压力（环境，抗生素治疗等）对氧化还原稳态的影响，以及如何在结核分枝杆菌中维持这种状态。

适应宿主压力的细菌会导致细胞表面重塑吗？
分枝杆菌细胞包膜对宿主环境的结构和功能适应有助于其存活和致病性。 分枝杆菌不对称地分裂和沉积新的细胞壁物质、细胞表面蛋白、分泌、酶和调节复合物、宿主遇到的应激源可能导致子代细胞的生长速率和大小发生变化，这种异质性可能导致对宿主遇到的应激源的反应不同。 重要的是，流式细胞仪提供了评估这些异质性特征的合适工具。

分枝杆菌生长的异质性已被证明与药物耐受性有关，这反过来又会导致治疗失败。在基于FACS的转座子筛选中，钙黄绿素-乙酰氧基甲酯（calcein-AM）被用来检测体外不对称生长相关的基因。钙黄绿素-AM是一种非荧光分子，通过被动扩散进入细胞，以响应于酯酶的活性而产生荧光分子钙黄绿素。这种方法鉴定了lamA，它编码分枝杆菌分裂复合体的一个成员，该复合体通过抑制新生极的生长来控制细胞生长的模式，从而在极性生长中产生不对称性。钙黄绿素荧光分布的变异性与药物敏感性的异质性相对应，因此缺乏lamA的细胞表现出更统一且对利福平和靶向细胞壁的药物具有快速杀灭作用。霉菌酸合成酶InhA的极性和隔膜定位可能进一步解释了INH的可变活性。另外，在持续过程中，分枝杆菌细胞壁的增厚会形成渗透屏障，并可能限制药物的进入。与使用显微镜活跃生长的对数中期细菌相比，用钙荧光白对多糖进行的特异性染色显示，在持久性细胞的增厚细胞壁中多糖的含量增加。此外，流式细胞仪分析表明，利福平偶联的5-羧基荧光素（5-FAM-RIF）是一种胺反应性探针，具有低渗透性，为持久性机制提供了支持。

分支链霉菌转移酶在分枝杆菌细胞包膜的结构和组装中起着至关重要的作用，有助于营养获取、细胞包膜的完整性以及对宿主环境的保护。由抗原85（Ag85）复合物（Ag85A，Ag85B和Ag85C）组成的大量分泌的霉菌转移酶分别将长链的分支支链霉菌酸共价或非共价整合到阿拉伯半乳聚糖或海藻糖糖脂中。由于这些高度免疫原性的成分对于分枝杆菌的生存力和毒力必不可少，因此它们可能是抗原检测的目标。荧光海藻糖类似物的合成利用Ag85配合物的代谢转化，将海藻糖霉菌酸酯作为海藻糖霉菌酸酯并入真菌膜中，而不会干扰霉菌酸的排列。重要的是，这些特异的细胞壁糖脂具有高度的抗原性，是病原性分枝杆菌细胞包膜功能，致病性和持久性的重要组成部分，也使得流式细胞仪检测结核分枝杆菌的特异性大大增高。抗原特异性抗体结合不同的荧光团已被用于研究结核分枝杆菌细胞膜上抗原和表面蛋白的变化和分布。

用含有末端化学报告物（例如叠氮化物、炔烃或荧光标签）的海藻糖类似物代替天然霉菌酸酯，然后使用点击化学方法对标记的霉菌烯基受体进行荧光标记。这样可以提高新陈代谢的结合效率，并在第二个标记步骤中将辅助标签传递给海藻糖类似物，从而带来好处。此外，标记了膜的霉菌酰化成分，可对感染期间的细胞壁代谢和糖脂分布进行全面分析。或者，基于FRET的海藻糖类似物可促进对Mycolyltransferase活性的了解，而无需标记真菌膜成分。从而通过用荧光猝灭剂修饰的海藻糖的Ag85加工介导荧光。在这些研究中，流式细胞术可以可视化荧光（标记的时间、结合亲和力和生长阶段依赖性），这可以增进我们对涉及肌膜重构的生物合成途径的理解。据报道海藻糖类似物有数种修饰，影响标记效率和光谱特性，从而扩展了其潜在的应用范围。

流式可利用与4-N，N-二甲基氨基-1,8-萘二甲酰亚胺结合的海藻糖（称为DMN-Tre），能够快速检测痰样中的结核分枝杆菌。 DMN-Tre标记取决于肌膜生物合成，探针通过代谢转化为肌膜来特异性靶向海藻糖，从而提供了一种代谢活跃、可行的分枝杆菌的方法。此外，抗生素治疗所致的细菌以其DMN-Tre标记强度降低为特征。相比之下，使用传统的金胺染色和显微镜无法区分抗生素受损的细胞，强调了将DMN-Tre与流式细胞仪结合使用作为有前途的治疗工具。此外，通过替代的生物合成途径进行的探针掺入可能会增强我们对应激过程中分枝杆菌细胞壁重塑程度的了解，例如，对于在延伸过程中提供细胞壁支持至关重要的细胞壁肽聚糖合成，可以使用流式细胞仪通过用D-氨基酸标记结核分枝杆菌来表征。另一项研究利用特定的双靶标，酶反应性荧光探针响应结核分枝杆菌的β-内酰胺酶活性和细胞壁阿拉伯聚糖的合成，使用流式细胞仪对痰液样本中的活细菌进行快速标记。

许多结核分枝杆菌的细胞表面蛋白都具有粘附素活性，例如甘露糖帽的脂质阿拉伯糖甘露聚糖（ManLAM）和苹果酸合酶，它们分别代表关键的糖脂和乙醛酸分路中的必需酶。由于ManLAM可以被巨噬细胞上的多种受体识别，因此适配体的设计与流式细胞仪已被用于确定细胞壁各成分与宿主细胞受体的相互作用如何导致细胞壁的产生。促进免疫调节的不同信号途径。结合流式细胞仪，与ManLAM结合的适体设计可能会重组细胞壁，因为它破坏了与甘露糖受体的相互作用并诱导了iNOS和与M1极化相关的炎性细胞因子的产生，从而缩短了感染的进程。适配体是短的寡核苷酸或肽分子，它们与靶分子具有高特异性结合，使用通过SELEX技术进行的适配体选择具有以下优势：它们比抗体更容易生产，并且具有调节基因表达的水平和时间的能力。另外，适配体可用于控制合成核糖开关，并已被用于严格调节分枝杆菌基因的表达。当与流式细胞术结合使用时，可用于评估基因表达并在体外培养中或在巨噬细胞感染的情况下追踪细。

结论
提供有效的结核病治疗相关的挑战与结核分枝杆菌适应细胞内生存方式之间，有着内在的联系。 但是，我们对结核分枝杆菌如何能够在真核细胞和器官中生存和持久的了解是有限的。 流式细胞术等工具的最新应用极大地提高了我们对结核分枝杆菌应对宿主应激源和抗生素治疗的生理学和病理学的理解，并提供了解决问题强有力的工具。

流式中文网编译自信源：Parbhoo T, Sampson SL, Mouton JM. Recent Developments in the Application of Flow Cytometry to Advance our Understanding of Mycobacterium tuberculosis Physiology and Pathogenesis [published online ahead of print, 2020 May 21]. Cytometry A. 2020;10.1002/cyto.a.24030. doi:10.1002/cyto.a.24030

Veblen

谢谢老师的分享，翻译出来可真不容易。