使用阿霉素诱导细胞凋亡，如何扣除阿霉素的干扰？

angelazyb

我正在做细胞凋亡的实验，其中使用的阳性药物是阿霉素。查阅资料发现阿霉素的发射波长为575-585 nm，会对传统的FITC/PI染色结果产生干扰。现在我老板让我做一个实验，检测给药多久之后阿霉素刚好进入细胞，然后扣除这个背景。想请问一下各位老师这种操作行得通吗？如果可以，应该如何操作？谢谢！


如图，这是我做的阿霉素诱导细胞凋亡的结果图，使用的机器是BD C6 Plus，试剂盒为BD试剂盒。


谢谢给位老师

niwanmao

凋亡试剂盒改用7-AAD和Annexin V APC。不能用PI。

angelazyb

niwanmao 发表于 2020-6-20 20:39
凋亡试剂盒改用7-AAD和Annexin V APC。不能用PI。

谢谢倪老师
想请问一下使用背景扣除的方法，结果不可靠是吗？

niwanmao

angelazyb 发表于 2020-6-22 08:17
谢谢倪老师
想请问一下使用背景扣除的方法，结果不可靠是吗？

如果你用了与阿霉素相同通道的荧光素，是扣除不掉的。
所以要尽量避开PE及邻近的通道。

angelazyb

niwanmao 发表于 2020-6-22 08:24
如果你用了与阿霉素相同通道的荧光素，是扣除不掉的。
所以要尽量避开PE及邻近的通道。 ...

好的，谢谢老师。
我刚开始做流式，有好多不懂。
如果使用AnnexinV-APC/7-AAD做凋亡，是不是通道都需要改变呢？我们的机器是BD C6 Plus，后续还需要像PE染色一样调节补偿吗？
谢谢老师回复。

niwanmao

angelazyb 发表于 2020-6-22 08:35
好的，谢谢老师。
我刚开始做流式，有好多不懂。
如果使用AnnexinV-APC/7-AAD做凋亡，是不是通道都需要改 ...

需要调节补偿。

angelazyb

niwanmao 发表于 2020-6-22 08:59
需要调节补偿。

我看使用AnnexinV-APC/7-AAD做凋亡的时候，无需做单染管，那么请问老师如何调节补偿呢？谢谢老师

niwanmao

angelazyb 发表于 2020-6-22 11:07
我看使用AnnexinV-APC/7-AAD做凋亡的时候，无需做单染管，那么请问老师如何调节补偿呢？谢谢老师 ...

「使用AnnexinV-APC/7-AAD做凋亡的时候，无需做单染管」指的是AnnexinV-APC/7-AAD两个荧光素之间没有明显干扰。
但是7-AAD和你这里的阿霉素之间，会有干扰，所以需要调节补偿去掉。

chunfeng

niwanmao 发表于 2020-6-23 12:26
「使用AnnexinV-APC/7-AAD做凋亡的时候，无需做单染管」指的是AnnexinV-APC/7-AAD两个荧光素之间没有明显 ...

倪老师，请教一下。如果 “APC和7-aad做凋亡不需要做单染管”那么如何确定这两个通道的合适的电压呢？我自己做的时候还是设置了两个单阳管，就像发给您请您帮忙分析的数据里一样，我是根据两个单染管来调节它们各自通道的电压。做完后 FLOWJO的自动调补偿，基本就是我自己设置的那样。如果确实可以省略单染那就太好了

niwanmao

chunfeng 发表于 2020-10-19 19:07
倪老师，请教一下。如果 “APC和7-aad做凋亡不需要做单染管”那么如何确定这两个通道的合适的电压呢？我 ...

这两个通道之间几乎没有补偿，所以我个人觉得不需要设置单染管。
至于你所说的电压，是涉及到电压的优化，可参考2016年ISAC年会上的建议：https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5235-1-1.html