细胞膜蛋白与PI双染

SHAW

想做PI和FITC标记的CD168的流式双染检测，现有的PI是凯基的周期测试试剂盒，想用PI检测DNA含量，四倍体还是二倍体。CD168检测膜蛋白，探索四倍体同时膜蛋白阳性的细胞比例。请问步骤是怎样呢  文献里有看到类似的图  但没有步骤  请老师讲一下。因为PI周期检测是要4°70%乙醇孵至少两个小时  最后PI孵育45min上机  那FITC什么时候染呢  。

附上文献的图

                               
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niwanmao

先染表面CD168 FITC，后进行乙醇固定染PI，需加RNAse，但是乙醇固定对表面标记其实影响挺大的，这个文献里面的图有点怪的。

SHAW

niwanmao 发表于 2020-6-30 20:28
先染表面CD168 FITC，后进行乙醇固定染PI，需加RNAse，但是乙醇固定对表面标记其实影响挺大的，这个文献里 ...

之前做过两次，先乙醇固定两个小时，然后染CD168，再染PI（PI+RNAse），结果两次CD168染不上。请问老师，1. 先染FITC，之后固定，后续时间很长，FITC会淬灭吧，2. 而且按照做凋亡的思路，FITC标记后，固定会导致荧光会淬灭？请老师解答下 ，什么顺序比较好呢，或者有其他什么染色方案

niwanmao

SHAW 发表于 2020-7-1 21:53
之前做过两次，先乙醇固定两个小时，然后染CD168，再染PI（PI+RNAse），结果两次CD168染不上。请问老师，1 ...

先固定的话，会影响表位构象，很可能染不上。先染再固定也会影响荧光，但是不会这么容易淬灭，凋亡不一样，Annexin V的结合条件特殊。