请问细胞PMA刺激后怎么处理能放置1-2天再测且不影响检测？

sugarswallow

最近做了IL-17\IFN-R等检测，因为收到血液标本已经很晚了，这个时候分离出PBMC后有几种处理方式:
1. 分离出PBMC用PMA+IONO+BFA刺激后，4h后继续检测胞内因子
2. 如果时间太晚，不能立即检测，那么有两种处理方式：
  2.1 分离PBMC后继续用1640完全培养基培养，第二天一早来刺激后，再做流式 检测
  2.1 新鲜分离得到的PBMC先刺激后，再固定后再检测：这里又有几种方式：
        2.1.1 刺激结束后，用百分之几？？甲醛溶液固定后，置于冰箱，第二天FACS染色和检测
        2.1.2 刺激结束后，先染表面标志，再用百分之几？？甲醛溶液固定后，置于冰箱，第二天胞内染色和检测
        2.1.3 刺激结束后，先染表面标志，再用穿膜液穿膜过夜，置于冰箱，第二天胞内染色和检测

不知道上述哪种方式flower们实施过的，效果怎样？影不影响检测结果？有没有做个比较？

  对了，如果用甲醛固定，请问甲醛溶液的浓度和具体固定步骤？

希望能多交流！我也会做这几种方案的实验摸索！

niwanmao

目前暂时没做过这方面的检测，先加精华，等待sugarswallow分享经验。我目前只能从理论方面说点建议：
1、可参考这本书的相关做法，其中提到一个TACE抑制刺激：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... E%E5%9B%A0%E5%AD%90
2、无法及时处理的做法我倾向于2.1.2的做法。
3、固定的话是不是用1％多聚甲醛更好呢？

aninawang

上述的方法没有完全实验过，不过有如下体验：1.分出PBMC放培养基过夜，刺激，染色；2.如果时间来得及，包膜胞浆染色完成后，0.5%-1%多聚甲醛固定，第二天上机检测；3.有时候先染包膜，到穿膜的那一步，穿膜过夜（不是多聚甲醛固定），不过这样可能要考虑到穿膜液种类。

niwanmao

aninawang 发表于 2011-4-6 20:03

                               
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上述的方法没有完全实验过，不过有如下体验：1.分出PBMC放培养基过夜，刺激，染色；2.如果时间来得及，包膜 ...

如果染色完成之后，我从来不用多聚甲醛固定过夜，而是尽可能早点上机，因为我相信随着时间的延长，荧光会逐渐衰减，当然，如果某个胞膜抗原很强，而且只是用来分群用，用不到它的表达率，那么我想过夜也没什么问题。

sugarswallow

当然最好的方式：刺激后直接做流式
固定：理论上说最好先将细胞固定最好，我曾经的尝试：刺激后的细胞收集后，先用4%多聚甲醛固定10min，而后，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬过夜，到第二天早上来做表面和胞内染色，这样做应该是没有问题的，唯一的就是要验证固定后的细胞的表面抗原的染色是否受影响！我也检测出来过，但是没有刺激后直接做流式比较过！不知道是否有影响。
原本昨天想试一下，结果没有找到PBMC,只有改天了！
对了，在联科的胞内因子染色中说是：BFA的封闭效果好于莫能菌素，也看了BD的gorgistop的说明书，这两种阻断剂的选择根据检测不同的细胞因子。不知道对于IL-17大家有没有体会？

sugarswallow

那这样的话就只有养一天，第二天一早来刺激了！试试这种方法也可以！

sugarswallow

实验结果分享：
用了上述几个条件做实验：结果如下：
1.不影响试验结果的方案：
   先染表面标志，再用通透液固定通透过夜（Ebioscience）（小于24h），第二天洗涤后加胞内检测
2.多聚甲醛影响CD4与抗体的结合：先用4%的多聚甲醛固定10min，洗涤后PBS重悬放置过夜，第二天加先加表面，再加胞内，按常规进行，发现固定后对CD3没有影响，但是对CD4影响很大。胞内的标志不影响！

niwanmao

sugarswallow 发表于 2011-4-11 16:05

                               
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实验结果分享：
用了上述几个条件做实验：结果如下：
1.不影响试验结果的方案：

感谢分享。多聚甲胞醛固定后肯定会对表面抗原位点的构象有影响，因此第二种方法影响了CD4，而CD3可能其胞内、胞外均存在一些结合位点，所以影响比较小。

sugarswallow

还有，就是BFA和莫能菌素的阻断剂，对于IL-17的频率检测是没有区别的，只是BFA那组的细胞的非特异荧光强一些，因此，同样的电压，BFA组的电压有些往上飘！

samly0

我做过这个：刺激结束后，先染表面标志，再用固定液固定过夜，置于冰箱4°，第二天洗涤完固定液后加穿膜液和胞内染色抗体染色2h后上机检测。完全可以检测得出来，用的是ebioscience家的固定剂和穿膜液。