PI染色检测转染GFP细胞的细胞周期，拟合RCS值偏大

lulixian669

我刚开始学习PI染色测量细胞周期，流式仪器是BD的celesta，检测pi荧光通道选择PE，收集的细胞数目约2w左右。
1、每次拟合的时候G0/G1峰很高而且特别窄，G2峰的位置也很明显，但是RCS值一直比较高，一般都在3以上，我看网上一些其他人的结果，RCS值都在1左右，不知道是什么原因，而且我发现如果收集的细胞增多，RCS值会进一步升高。
2、因为我的细胞感染了病毒，有GFP，但是因为细胞纯化过了，纯度95%以上，所以GFP在检测周期时并没有用到，相反就是一个干扰。学习了倪老师的帖子，按照常规70%乙醇固定后，检测到细胞自带的荧光基本没有了（与未感染GFP的细胞相比，位置基本一致，荧光强度低于10^2），不知道这样是否仍有补偿干扰的问题。

niwanmao

个人的建议：
1、粘连体门按如下图绿色线这么圈：


2、峰的位置，G2峰做一下微调，用Sync wizard界面，将G2峰拖到合适的位置。

这样，应该RCS应该会好一些。但实际上，只要曲线拟合基本反映真实分布，一般问题不会太大。

lulixian669

niwanmao 发表于 2020-9-9 14:26
个人的建议：
1、粘连体门按如下图绿色线这么圈：

谢谢倪老师指点，我试过调节R2的门位置，RCS值会减少但是也不会降低很多，我自己觉得曲线拟合度还是挺好的，就是不知道这个值还跟哪些因素相关，是不是自己有其他地方没有注意到。

还有就是第2个问题，就是带GFP的细胞，直接用乙醇固定之后荧光基本就消失了，这样还涉及到补偿调节吗。因为这个荧光对周期检测没啥用，我就没有参照倪老师的另一个带荧光细胞的周期检测的帖子。

sunzheng_99

RCS，是一个统计学上的指标，用来反应你所选择的这个模式与你的标本的拟合程度，0.9-3.0为比较好的一个范围，而3.0-5.0为可以接受，小于0.8或是大于5.0，都被视为不可接受

niwanmao

lulixian669 发表于 2020-9-9 14:59
谢谢倪老师指点，我试过调节R2的门位置，RCS值会减少但是也不会降低很多，我自己觉得曲线拟合度还是挺好 ...

你在常规软件里面看看，荧光spillover是否明显，一般应该还好的。

lulixian669

sunzheng_99 发表于 2020-9-9 15:08
RCS，是一个统计学上的指标，用来反应你所选择的这个模式与你的标本的拟合程度，0.9-3.0为比较好的一个范围 ...

这个要求我也查到了，我也是尽量再调整，看如何把曲线拟合程度与这个统计指标都能得到一个好的结果，因为不同样本拟合出来RCS值波动在3-6之间，一直很难保持在3以内，但是网上有很多图形明显拟合的不好，峰也很宽大，但是RCS值却很低，不知道我自己的问题在哪里。希望能给我指导。

lulixian669

niwanmao 发表于 2020-9-9 15:13
你在常规软件里面看看，荧光spillover是否明显，一般应该还好的。

倪老师，我按照你的调整了R2门的位置，但是RCS更大了，还有就是Debris的位置到底应该怎么放，还请老师帮忙。

lulixian669

这个是我的流式文件，请各位老师看看问题在哪里。

sunzheng_99

在MODFIT 软件中有个倍体选择  选1.95 或1.90 再分析  也许会。。。

lulixian669

sunzheng_99 发表于 2020-9-10 08:30
在MODFIT 软件中有个倍体选择  选1.95 或1.90 再分析  也许会。。。

已经都试过调整了，现在RCS值最小，但是G2峰的位置并不是最佳，选择1.96时G2峰的位置更合适，但是RCS值会增加。