稀有细胞

niwanmao

从基础研究到转化医学和诊断学，稀有细胞群体在各个领域中的重要性与日俱增。 在一些临床环境中，稀有细胞计数提供了关于患者病情和分期的有价值的信息，例如外周血中罕见的CTC、肿瘤干细胞、循环内皮细胞、造血祖细胞及其亚群，以及母体循环中的胎儿细胞。 稀有细胞分析的有趣应用包括检测转移的乳腺癌细胞或侵入骨髓的神经母细胞瘤细胞、监测微小残留病、检测外周血中的干细胞和罕见的HIV感染细胞、抗原特异性T细胞、固有自然杀伤T(iNKT)细胞，以及遗传毒理学中的突变频率分析。 此外，功能分析，如抗原诱导T淋巴细胞产生不同的细胞因子，也需要在这些T细胞群中寻找稀有细胞。

研究稀有细胞需要注意所有阶段的最佳方法，包括生物样本的收集、明确的对照以及软件和硬件的充分使用。 术语“罕见”通常指的是比例在0.01%或更低的事件，尽管文献中长期又来认为外周血液中每1000万个细胞检出1个肿瘤细胞才算。 为此，获取大量事件和高信噪比是最相关的方面。

1、生物样本的数量
根据要检测的稀有细胞的估计比例，计算需要多少生物样本是很关键的。 例如，如果实验的终点是计数脑脊液(CSF)中存在的稀有细胞群，考虑到从患者身上只能获得几毫升，那么必须使用所有的CSF才对。但如果用的是血液，那么应该需仔细计算数量。如果这项研究的终点是评估HIV感染患者中iNKT细胞等细胞在体外刺激后细胞因子的产生，则应该考虑一些分析前的考虑因素。 例如，iNKT细胞在外周血单核细胞中非常罕见(0.01-1%)，为了定义这个群体，必须使用几个标记，包括识别CD3、CD4、CD8、固有TCR等的标记，以及细胞活力的标记，还有一些胞内细胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-17，这意味着至少需要九个标记。 未接受抗逆转录病毒治疗的HIV+患者免疫功能明显受损，CD3+T淋巴细胞数量较少。 因此，检测合理数量的稀有细胞(根据泊松统计)所需的血量可能多达50毫升，因为必须分析静息或刺激的细胞。

2、富检和标记的选择
基于实验目的(例如表型、功能分析)，稀有群体可以被富集或不被富集，并且需要明确识别稀有细胞所需的标记数量。 例如，循环内皮细胞及其祖细胞的精确定量，如下图所示，是一个有争议的问题。 已经发表了几项研究，但到目前为止，无论是应该用来鉴定这些细胞的标记，还是分析前富集的必要性(通过密度梯度和/或磁性富集)，都没有达成共识。

然而，如果稀有细胞丢失，富集可能会产生负面影响，但如果去除不需要的细胞，富集又是正面的。 不幸的是，很多时候，缺乏很好的标准化方法影响了对识别感兴趣群体所需的标记数量的确定。 根据荧光通道数目和采集速度不同的流式细胞仪的技术特点，应确定能够识别和表征这类群体的最重要的标志物，例如，针对iNKT细胞，Vα24Jα18 TCR是对最准确的识别标记物。 在这样做之后，标记方案必须遵循一个一般规则，即必须使用最亮的荧光素标记最弱的抗原。 最后，应注意补偿和FMO对照的获取。

3、获取的事件数量
关于需要获取的事件数量，建议使用泊松统计，该统计定义了给定数量的事件将在固定的时间/空间间隔内发生的概率，假设这些事件将以已知的平均速率发生，并且与从前一事件经过的时间无关。 下表为一个检测0.01%事件的例子，这是研究抗原特异性T细胞时经常发生的情况。

这显然是理想的。 然而，现实生活与理论是不同的，很多时候，最终的事件数量不足以满足这一黄金法则。 例如，我们可以考虑这样的情况，其中100万个外周T细胞被一种抗原刺激，而该抗原对其中不到0.1%的T细胞有激活作用，即每百万个细胞中有100个细胞被激活。 现在，通过多色流式细胞术，可以通过评估这些细胞的多功能性来分析T细胞的激活，并且已经开发出可以相对容易地识别每个细胞四种甚至五种功能的方案。 因此，在反应细胞中，最多可以存在32个群体，可能具有不同的比例，每个亚群包含几个在对照的、未刺激的样本中完全不存在的细胞。 即使这些细胞的数量比严格的统计方法所显示的要少得多，我们还能认为它们是阳性的吗？ 这一领域的意见领袖马里奥·罗德尔(Mario Roeder)的一篇关键论文给了我们非常有用和明确的建议：事实上，如果可以排除对这种阳性事件存在的其他解释(即，如果没有由于死亡细胞或片段引起的噪音，如果细胞激活确实是由于体外使用的抗原，而不是由于体内T细胞的预激活)，则这些事件可以被认为是阳性的，无论它们的数量如何。 因此，没有理由为事件数量设定阈值。 在这种情况下，可以在将测量与一组对照样本(其中包括适当的阴性对照)进行比较之后，使用标准统计工具来比较频率，从而确定“阳性”。

4、阈值、设门和Dump通道。
阈值应该是固定的，以便将定义感兴趣的总体所需的信号(使用荧光或散射)与噪声/背景区分开来。 因此，使感兴趣区域的信噪比最大化是强制性的。 设门，需要通过死活标记排除死细胞，排除粘连体、碎片和所有不需要的细胞。 此外，使用参数“TIME”加上感兴趣的参数形成的散点图可以消除采集过程中由堵塞或其他瞬态问题引起的异常。 仪器应保持清洁，必须在采集不同样品之间清洗仪器，以最大限度地减少可能导致检测到假阳性事件的样品污染。

5、数据分析
数据分析需要足够的软件和强大的硬件(超过8 GB RAM或更高)，因为采集的数据文件往往很大，这取决于采集了多少事件和参数(例如，10种荧光和2个散射光，1000万个事件，这对您的计算机来说会是一个很好的测试数据)。 为了最小化文件大小，可以取消选择那些不是真正需要的参数，并且可以使用荧光/散射光阈值触发设置，减少碎片的获取。

参考文献：Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019;49(10):1457-1973. doi:10.1002/eji.201970107