自带GFP绿光的细胞做细胞凋亡AnnexinV FITC/PI检测，无双阳群...

吴玉霜

自带GFP绿光的细胞做细胞凋亡AnnexinV FITC/PI检测，无双阳群，是为什么？

检测背景：细胞转入自带GFP绿光的病毒，用AnnexinV FITC/PI的组合检测细胞凋亡。对照组用高糖培养基处理，实验组用不同糖浓度培养基处理。理论上，细胞凋亡率增加，结果发现从对照管开始，对照管和实验管均无双阳群（如下图）。

对照管，高糖浓度

实验管1，较高糖浓度

实验管2，最低糖浓度

有两点疑问：

1.为何自带GFP绿光，却检测不到双阳群？照理来说，自发GFP绿光，应该会有FITC单阳群或双阳群。并且此次结果PI单阳群很明显，说明PI是能够染上的。

2.若细胞自带的荧光与AnnexinV的荧光抗体光谱重叠，在不改变荧光抗体组合的情况下，应该如何去计算细胞的凋亡率？（考虑到更换试剂的成本）

hezeljgouc

1. 不知道你的具体染色步骤，根据结果分析，最大的可能是Annexin-V-FITC没有标记上，直接证据就是PI阳性的死细胞没有Annexin-FITC绿荧光，建议重新优化染色方法。至于Q1门PI阳性细胞中为什么也没有GFP绿荧光，可能是细胞在表达出GFP蛋白之前已经死亡，或者细胞凋亡过程破坏了GFP蛋白，或者死亡细胞膜全通透GFP蛋白从细胞内流失了。
2. 建议更换Annexin-V-APC或其他荧光素标记，一般流式细胞仪无法区分FITC和GFP，如果不更换试剂的话，绿色荧光通道（如530/30）永远是FITC+GFP的总荧光信号，根本无法分析凋亡率。

tiger

hezeljgouc 发表于 2020-10-19 09:48
1. 不知道你的具体染色步骤，根据结果分析，最大的可能是Annexin-V-FITC没有标记上，直接证据就是PI阳性的 ...

Annexin-V-FITC有可能标上了，但早期凋亡细胞与GFP无法区分，都是FITC单阳。

hezeljgouc

tiger 发表于 2020-10-19 12:50
Annexin-V-FITC有可能标上了，但早期凋亡细胞与GFP无法区分，都是FITC单阳。

也有可能。我还是倾向于没标记上，一般情况下PI阳性（晚期凋亡或死亡）细胞大部分应该是Annexin-V阳性，但是他的样品不是

niwanmao

我和@hezeljgouc 的观点相同，可能性最大的是Annexin V FITC没染上，所以FITC出现的都是GFP+信号。
至于想利用现有试剂做的话，不是很建议，因为只能通过PI+来区分，但PI+确定为凋亡的观点还是有争议的，因为究竟是晚期凋亡还是坏死，各有说法。

吴玉霜

非常感谢大家的解答受益匪浅

tiger

hezeljgouc 发表于 2020-10-19 14:50
也有可能。我还是倾向于没标记上，一般情况下PI阳性（晚期凋亡或死亡）细胞大部分应该是Annexin-V阳性， ...

晚凋或坏死细胞膜不完整，GFP漏出，所以没有双阳性细胞。早凋细胞FITC信号被GFP掩盖。

niwanmao

tiger 发表于 2020-10-20 09:14
晚凋或坏死细胞膜不完整，GFP漏出，所以没有双阳性细胞。早凋细胞FITC信号被GFP掩盖。 ...

学习了，这个原理是否有文献支持呢？学习一下。