小鼠脾脏treg检测细胞活性差，碎片多

健忘de熊猫

       小白刚开始做流式，目标是小鼠脾脏的treg细胞，目前卡了一个月了，细胞活性一直很差，碎片很多，CD25染得也不好。之前采用的是4℃过夜破膜破核，看的坛子里有朋友说这样子会导致细胞碎片增加，活性变差，所以今天试了试室温和4℃下破膜破核30min，1h和2h，还是不行。目前考虑是不是涡旋时间过长，每次加完抗体之后涡旋细胞10秒以上，涡旋幅度比较大，破膜破核涡旋20秒，考虑是不是这个的原因，下面上几张失败的图，还请各位多多指教，谢谢！
      图片上描述是日期，相同日期一张是FSC/SSC，一张是CD25和Foxp3，让我百思不得其解的是FSC/SSC的细胞分布像是一个矩形，想知道为什么会出现这种情况？

niwanmao

健忘de熊猫 发表于 2020-10-19 17:23
您看上去问题出在哪儿呢，改进了步骤都还是染不出来

首先，你将坐标范围设置正确之后，按照正确的设门步骤走下来，看效果。
其次，你关注一下你所用的抗体克隆号、破膜剂类型，是否与权威文献中报告的一致。

niwanmao

这个矩形，应该和你用的流式细胞仪有关，不知道你用的是什么型号。你可以通过调节flowjo上的显示坐标，来把外框调到坐标最大值那里。

健忘de熊猫

niwanmao 发表于 2020-10-19 15:02
这个矩形，应该和你用的流式细胞仪有关，不知道你用的是什么型号。你可以通过调节flowjo上的显示坐标，来把 ...

用的beckman的dxfly，不太好用

健忘de熊猫

niwanmao 发表于 2020-10-19 15:02
这个矩形，应该和你用的流式细胞仪有关，不知道你用的是什么型号。你可以通过调节flowjo上的显示坐标，来把 ...

请问细胞涡旋剧烈了会影响活性，导致细胞碎片增多是嘛？

niwanmao

健忘de熊猫 发表于 2020-10-19 15:58
请问细胞涡旋剧烈了会影响活性，导致细胞碎片增多是嘛？

那个边框不是碎片，而是非特异性信号，由于DxFLEX的坐标范围大，所以Flowjo与其兼容性不是很好，但是可以通过调节适应的。

健忘de熊猫

niwanmao 发表于 2020-10-19 16:09
那个边框不是碎片，而是非特异性信号，由于DxFLEX的坐标范围大，所以Flowjo与其兼容性不是很好，但是可以 ...

您看上去问题出在哪儿呢，改进了步骤都还是染不出来

ucbio

上传一个今天做的脾脏Treg，不对之处多多指教。

陈景飞

ucbio 发表于 2020-10-31 18:49
上传一个今天做的脾脏Treg，不对之处多多指教。

你是不是设置阈值滤过了碎片，我看左边缺了一大块的样子

Jeff

个人感觉小鼠的FOXP3，还是Thermo的最好用，可以尝试下~~当然，破核剂的选择也非常重要，可以选择厂家推荐的破核剂，按照标准实验流程来操作，一般不会有太大问题