流式细胞仪光路的维护

niwanmao

维护流式细胞仪，意味着监控有关仪器实际状态的信息，并将其与原始(理想)状态进行比较。 应确保数据是在可比较的条件下收集的，例如可比较的激光预热时间(在15至30分钟之间)、鞘液设置(选择相同的流速：低、中、高)和事件速率。 如果性能检查失败，则需要知道如何将其恢复到原始级别(如果可能)。
维护从清洁仪器开始。 为了防止受到激光辐射或电气危害，请在不开机的情况下完成。
需要清除通风系统中的灰尘，以便对激光器和电源以及光学滤光器(BP、SP和LP)、(分光)反射镜和光路棱镜进行有效的风冷。 灰尘会产生额外的背景和荧光信号的损失，从而影响荧光信号的激光对准和灵敏度。这些部件可以用无污染的加压空气清洁。若灰尘不容易吹掉，可以用棉布或无尘纸巾加一滴纯甲醇润湿（显微镜中使用的那种，因为甲醇会蒸发，不会在光学系统上留下残留物)。 这些类型的预防性维护需要多久进行一次，严格取决于环境条件，有时包含在供应商的维护合同中。

许多流式细胞仪的激光通过玻璃纤维引导到检测位置，因此，随着时间的推移，它们的对准还是相对稳定的，而且光学工作台基本上都固定的，所以几乎不需要重复进行激光和滤光片的校准。 但无论如何，在测量之前检查(或“了解”)仪器状态是很重要的。BD的CS&T模块(从软件版本DIVA 6.0开始提供)就是一个示例，介绍了如何随时间监控仪器性能(具体详见BD Cytometer Setup and Tracking Application Guide V3.0)。 工程师初次安装好机器或更换部件(例如激光器、滤光片或PMT)后，仪器的状态将记录在所谓的“基线”中，后续每日跑一次CS&T微球，与其对比。对比指标包括了：每个PMT的线性范围(对于正确测量和补偿很重要)、电子噪声和背景(BR、SDEN)、探测器效率(QR)以及灵敏度、激光对准质量(%RCV)等大量信息。

下图就是利用CS&T性能检查的典型结果，不同时间点运行相同批次的标准珠子来跟踪仪器性能并与基线值进行比较。 然后，软件模块将报告观察到的每个指标变化。在下面这幅图中，PMT检测器前面的BP滤光片错误，导致信号较低。 因此，系统需要更高的光电倍增管电压(ΔV)才能达到为该特定通道定义的目标值。ΔV的变化大于接受范围(CS&T≤50V的默认值)，仪器性能失败并通知用户(警告标识)。


在没有CS&T选项的流式细胞仪上，通过使用几乎任何类型的标准化颗粒(例如Rainbow Beads、6峰或8峰微球、Calibrite Beads、CS&T Beads或其他荧光标记微球)，可以获得类似的结果。但是那样的话，需要自己生成包含所有荧光通道和参数的图，并定义校准标准，将结果保存为(仪器特定的)“标准”。 接着，每日或定期使用相同类型的微球(考虑并记录随时间的潜在批次变化)和相同仪器设置，与第一次“标准”测量进行比较，监控仪器性能的变化。 下图显示的是跟上面CS&T结果相同的结果，只不过没有用Diva自带的CS&T模块，但同样可以看出，使用正确的BP滤光片(510/50)，微球是落在目标值内的（蓝色曲线的阳性峰位于门内)，而使用错误的BP滤光片(610/20)，仪器性能检查就会失败(红色曲线)。


这样按照不同时间点(每天或每周)记忆所有参数的信息，可以很好地了解系统的性能。


除了目标通道之外，峰的形状和宽度也很重要，并且可以提示激光未对准等问题。 如下图所示，阳性微球峰仍在定义的目标区域内，但宽度(%RCV)是标准测量值的两倍。 重新对准激光器后，峰的形状和%RCV值再次在预期范围内。



参考文献：Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019;49(10):1457–1973. doi:10.1002/eji.201970107