磷酸化蛋白流式经验分享

麦小光

实验需要涉及到磷酸化的STING蛋白，对的，就是很火的cGAS-STING通路。胞内磷酸化蛋白一般都是用WB做，很少有人去做流式，为了丰富数据，我决定尝试一下。但是看了群里面的经验，发现主要是用甲醇固定破膜，所以我第一步首先用甲醇破膜，先看看效果。


结果却相当的不如人意，细胞碎得一塌糊涂，分群也特别不明显。
结果如下



可以很明显的看到，细胞已经稀碎，这对后面的结果也会带来不小的影响。


左边是对照，右边 是处理组，这么一点点，到底是有还是没有呢。。。我陷入了迷茫。


后来，在很多技术细节不断地改进，例如，这是铁壁细胞，消化的时候，用胰蛋白酶轻轻地消化到细胞变圆，但是还没有脱落的状态，弃去消化液，直接上固定液（因为没有染表面蛋白，只染胞内的p-STING。）等等，一系列改进，最后变成这样：


现在这个比例基本上可用了。但是我依然不满意，于是继续换，尝试了BD的破膜液，效果也一般，以及自己配置的皂素，NP-40等破膜剂，效果还不如之前。这里略去不谈了。

重点来了，最后更换了细胞，并更换了ebioscience的FOXP3破膜液，效果一下出来了。
结果如下：



可以看到，阳性群比之前高了一个数量级，这和我WB结果基本吻合了，这样有了WB和流式数据的相互验证，数据可信度高了不少。
另外：


细胞的形态也比之前甲醇破膜的好了太多。

前后来来回回折腾了一个多月，经历了二十次实验，最后终于得到比较理想的结果。
感想就是，找到合适的破膜剂以及细节改进小技巧。还有就是，能更换细胞系就可以尝试更换一下，别在一棵树上吊死

麦小光

stf1990 发表于 2021-7-20 21:15
你好站友， 我也是用的ebioscience 的Foxp3破膜套装，concentrate：diluent=1：3， 总体系200ul／tube。  ...

时间太长了，可以先摸索一下，个人建议根据细胞的不同，30-45min吧，太久了容易碎。而且量也可以适当减少，我一般200ul就可以了

麦小光

哎，对这个插入图片不熟悉，插图片折腾了好久，如果大家看图有问题，欢迎call我

麦小光

暂时还不能告诉大家这是什么具体的细胞，因为特征太明显，我的课题还在推进中，等后续实验差不多结束，我会把所有涉及到流式的经验一一发表成帖子。

niwanmao

这是非常有意义的经验分享，感谢，加星鼓励。

scaleus

请问有没有更详细一点的protocol，我们实验室正好也是ebioscience的FOXP3破膜试剂

niwanmao

scaleus 发表于 2021-6-21 21:12
请问有没有更详细一点的protocol，我们实验室正好也是ebioscience的FOXP3破膜试剂 ...

按试剂盒的protocol即可。

stf1990

niwanmao 发表于 2021-6-22 07:51
按试剂盒的protocol即可。

倪老师，FOXP3的破膜剂与常规检测细胞因子的破膜kit区别是啥？

niwanmao

stf1990 发表于 2021-7-13 15:56
倪老师，FOXP3的破膜剂与常规检测细胞因子的破膜kit区别是啥？

可破核膜。穿孔能力更强。

stf1990

麦小光 发表于 2020-10-24 20:52
哎，对这个插入图片不熟悉，插图片折腾了好久，如果大家看图有问题，欢迎call我 ...

你好站友， 我也是用的ebioscience 的Foxp3破膜套装，concentrate：diluent=1：3， 总体系200ul／tube。 但是2至8度破膜60分钟后，用buffer洗完，试管底部能看到明显的细胞碎片，这是破膜时间太长的缘故吗？