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[流式分选] 请教各位老师关于流式电压的疑问

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 楼主| 发表于 2020-11-13 13:54:42 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
请教各位,如图所示,为组织细胞悬液,已经圈出活细胞,DAPI检测活性大于80%。但是,电压调高以后阳性率明显升高,该如何解决?单单是电压对假阳性的影响就有如此之大吗 ?因为后续涉及到分选,如果是这种电压下,该如何设门分选出正确的细胞(理论上目标细胞占比小于2%)?谢谢各位老师!

                               
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发表于 2020-11-13 14:17:50 | 显示全部楼层
电压增大,那么阳性门的位置也会变,所以不能「刻舟求剑」似的评判表达率。一旦电压变动,那么你的阴性/生物学对照,都得重新跑过,才能正确放置阳性门位置。
 楼主| 发表于 2020-11-14 11:22:05 | 显示全部楼层
那请问老师,假设以上图这种情况,我的阳性门分别应该设在哪个位置才是正确的呢? 如果是按照对照来设在10^2附近,那么样本阳性率估计能高达20%,那显然不是正常的该种细胞比例。如果按照正常的2%的比例来主观设定样本最远端的2%为阳性门分选,放到对照组又离二抗阴性对照细胞群太过遥远了。 所以还有一种情况就是,是否是由于前期步骤导致非特异性染色过多而导致了其实已经是属于不正常而无法设门? 谢谢!
 楼主| 发表于 2020-11-14 11:22:47 | 显示全部楼层
补充一句:我说的“上图”指的是250mV的电压情况。
发表于 2020-11-16 14:34:06 | 显示全部楼层
我一般是把auto管的细胞群调到10^2位置向右偏移一点。
发表于 2020-11-16 15:38:52 | 显示全部楼层
286601845 发表于 2020-11-14 11:22
那请问老师,假设以上图这种情况,我的阳性门分别应该设在哪个位置才是正确的呢? 如果是按照对照来设在10^2 ...

分群不佳的时候,请记住一个原则:用生物学阴性对照或能够正确反映背景的FMO对照设门。
 楼主| 发表于 2020-11-19 01:05:42 | 显示全部楼层
一席繁荒 发表于 2020-11-16 14:34
我一般是把auto管的细胞群调到10^2位置向右偏移一点。

我尝试着调过,结果就是,并不是整个细胞群平行右移。 调高电压的结果就是下部分不会右移,上面往右移,形成一个向右斜的尾巴。此时再测样本,右斜的角度更大,甚至直接平铺在X轴上。 这样就直接覆盖了真正的阳性细胞。  请问你没有碰到这样的情况吗?(我的是组织细胞,不是血细胞,分群不明显)
发表于 2020-11-19 08:31:50 | 显示全部楼层
286601845 发表于 2020-11-19 01:05
我尝试着调过,结果就是,并不是整个细胞群平行右移。 调高电压的结果就是下部分不会右移,上面往右移, ...

我做过小鼠的很多组织细胞,并没有出现你说的这种情况,我们的流式是BD FACSCanto II,一般我们是从横坐标FSC纵坐标SSC里圈门,然后再直方图APC里调整电压
发表于 2020-11-19 10:44:59 | 显示全部楼层
286601845 发表于 2020-11-19 01:05
我尝试着调过,结果就是,并不是整个细胞群平行右移。 调高电压的结果就是下部分不会右移,上面往右移, ...

我和倪老师想法一样,建议你做一个FMO,这样的射门更精确一些。
另外,建议你尽量用直标抗体,二抗非特异性太高。
再者因为你的细胞阳性群分群不明显,射门主观性太强,必须想办法做一个严谨的生物学对照管。
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