查看: 103|回复: 6
收起左侧

[凋亡检测] 流式小白请教各位FITC-Annexin V/PI双染检测细胞凋亡

[复制链接]
 楼主| 发表于 2020-11-15 12:25:38 | 显示全部楼层 |阅读模式
10流星
检测方法:四正柏FITC-Annexin V/PI双染检测处理方法:所有分组的cells都经过碧云天细胞凋亡诱导试剂盒(TNF-α+SM-164)处理
检测仪器:BD C6(未调节补偿),用的FL1和FL3检测通道
分析软件:FlowJo X

小白刚刚入门,都是摸索着分析,有一些步骤和原理怕是不太了解,所以我会写出来,写得比较啰嗦,还请各位老师不吝赐教,指出错误。感谢!!!

分析流程:
1.用FlowJo调节补偿
(1)FITC 单染 ,FSC/SSC 圈选活细胞(目的是去除细胞碎片),设门选择FL1-A和FL1-H圈选阴性和阳性细胞群(我看有一些帖子用的是FL1+SSC?有什么区别吗)
单染FITC-圈选活细胞.png 圈选阳性、阴性细胞群.png

(2)PI单染同样操作
单染PI-圈选活细胞.png WeChat 截圖_20201115120455.png

(3)应用到all samples (不知道为什么阴性细胞群数量很少,而且histogram上看不到)
调节补偿.png

(4)空白组设定十字门位置 blank.png blank1.png

(5)双染组同样圈选活细胞,调用经过补偿的channel【comp-FL1A 和 FL3A】,设十字门划分
双染组1.png 双染组1-result.png

双染组2.png 双染组2-result.png

双染组3.png 双染组3-result.png

请问我上面的操作步骤有什么问题?能不能给一份详细一点的protocol,越具体越好,谢谢大家~
ps 附件是整个操作流程和凋亡诱导的试剂说明书








操作流程

操作流程

C0006 细胞凋亡诱导试剂盒(hTNF-α SM-164).pdf

741.34 KB, 下载次数: 1

发表于 2020-11-15 22:16:33 | 显示全部楼层
看分群应该是没问题的。
主要是要做两件事:
1、将坐标显示方式改为Logicle
2、补偿做微调。
 楼主| 发表于 2020-11-16 15:06:03 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-11-15 22:16
看分群应该是没问题的。
主要是要做两件事:
1、将坐标显示方式改为Logicle

谢谢倪老师的答复。

老师,再烦请教一下,①我把坐标改成logicle之后,为什么圈选的这一群才是活细胞,是怎么确定的呢?旁边也有一群荧光强度挺强的

log.png

②还有MFI这个指数请问是在哪里查看呢,我找了好久都没找着

发表于 2020-11-16 15:34:07 | 显示全部楼层
Cheung 发表于 2020-11-16 15:06
谢谢倪老师的答复。

老师,再烦请教一下,①我把坐标改成logicle之后,为什么圈选的这一群才 ...

哪群是目的细胞,你这里只能通过反设门确定。能够正确表达CD4、CD8、CD3的才算。
MFI,就是Geomean或Median,在图下方的Statistics里面找一下。
发表于 2020-11-17 09:12:14 | 显示全部楼层
补偿没调好,做凋亡尽量把所有细胞都圈起来,如果只圈活细胞,还怎么分凋亡细胞?
 楼主| 发表于 2020-11-17 11:03:12 | 显示全部楼层
xiaogang1 发表于 2020-11-17 09:12
补偿没调好,做凋亡尽量把所有细胞都圈起来,如果只圈活细胞,还怎么分凋亡细胞? ...

啊不好意思我说错了 应该是去除细胞碎片 那在3楼这样圈是ok的吗
 楼主| 发表于 2020-11-17 11:04:50 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-11-16 15:34
哪群是目的细胞,你这里只能通过反设门确定。能够正确表达CD4、CD8、CD3的才算。
MFI,就是Geomean或Medi ...

老师 那我是要全部圈起来吗还是说像3楼这样圈就可以了,旁边那些是细胞碎片吗 我这个不是淋巴细胞来的 只是忘了改过来 是tumor cells
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

关闭

本站推荐上一条 /1 下一条

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2020-12-2 10:27

Powered by Discuz! X3.4

© 2001-2013 Comsenz Inc.