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[淋巴细胞相关] 求教流式染色后为什么没有还是只有一个峰

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 楼主| 发表于 2020-11-19 20:27:33 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 wsjheaven 于 2020-11-19 20:29 编辑

求教
胸腺细胞进行CD3染色后,是有两个峰,但是阴性位置变了,而且也无法区分阴阳性,求教怎么回事?

谢谢

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发表于 2020-11-20 07:28:09 | 显示全部楼层
1、保证细胞活力。
2、请事先用Fc阻断剂
3、抗体滴度滴定好。
 楼主| 发表于 2020-11-20 11:35:50 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-11-20 07:28
1、保证细胞活力。
2、请事先用Fc阻断剂
3、抗体滴度滴定好。

倪老师,我这个是小鼠的胸腺,有用CD16/CD32做过封闭。
也染色做了细胞活力检测,结果是下面这个图,可以看到大部分还是活细胞。
所以可能是抗体滴度不够吗?


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发表于 2020-11-20 15:03:33 | 显示全部楼层
wsjheaven 发表于 2020-11-20 11:35
倪老师,我这个是小鼠的胸腺,有用CD16/CD32做过封闭。
也染色做了细胞活力检测,结果是下面这个图,可以 ...

用的是什么荧光素和Ig类型?
 楼主| 发表于 2020-11-20 15:16:21 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-11-20 15:03
用的是什么荧光素和Ig类型?

CD3用的是biolegend的APC anti-mouse CD3 Antibody,  Rat IgG2b, κ。 按照他的建议浓度0.5 µg per million cells in 100 µl volume。

其次还有个问题,就是大概多少量的细胞做一次比较合适,就表面marker染色和胞内分别有差别吗?因为我在做的时候,经过各种洗涤,细胞数量我能肉眼看到变少。或者还是因为我离心的问题吗?我是用500g  8min。

谢谢倪老师了
发表于 2020-11-20 20:09:27 | 显示全部楼层
wsjheaven 发表于 2020-11-20 15:16
CD3用的是biolegend的APC anti-mouse CD3 Antibody,  Rat IgG2b, κ。 按照他的建议浓度0.5 µg per mil ...

小鼠细胞小,可能需要增加离心力,否则容易丢失。
细胞量的话,表面和胞内差异不大。你上面说分不开,是胞内染色?
 楼主| 发表于 2020-11-22 12:25:33 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-11-20 20:09
小鼠细胞小,可能需要增加离心力,否则容易丢失。
细胞量的话,表面和胞内差异不大。你上面说分不开,是胞 ...

不是,上面说的分不开的是表面marker染色,染的是CD3,用的是biolegend的APC anti-mouse CD3 Antibody,  Rat IgG2b, κ。 按照他的建议浓度0.5 µg per million cells in 100 µl volume。
发表于 2020-11-23 09:07:05 | 显示全部楼层
wsjheaven 发表于 2020-11-22 12:25
不是,上面说的分不开的是表面marker染色,染的是CD3,用的是biolegend的APC anti-mouse CD3 Antibody,  ...

你的实际用量是多少呢?
发表于 2020-11-23 10:48:35 | 显示全部楼层
FSC/SSC的图最好也发上来看看
 楼主| 发表于 2020-11-23 11:20:16 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-11-23 09:07
你的实际用量是多少呢?

实际用量也是按这个算的,因为之前有做细胞计数,所以之后按那个比例加的抗体。
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