求教流式染色后为什么没有还是只有一个峰

wsjheaven

求教
胸腺细胞进行CD3染色后，是有两个峰，但是阴性位置变了，而且也无法区分阴阳性，求教怎么回事？

谢谢

niwanmao

1、保证细胞活力。
2、请事先用Fc阻断剂
3、抗体滴度滴定好。

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-20 07:28
1、保证细胞活力。
2、请事先用Fc阻断剂
3、抗体滴度滴定好。

倪老师，我这个是小鼠的胸腺，有用CD16/CD32做过封闭。
也染色做了细胞活力检测，结果是下面这个图，可以看到大部分还是活细胞。
所以可能是抗体滴度不够吗？

niwanmao

wsjheaven 发表于 2020-11-20 11:35
倪老师，我这个是小鼠的胸腺，有用CD16/CD32做过封闭。
也染色做了细胞活力检测，结果是下面这个图，可以 ...

用的是什么荧光素和Ig类型？

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-20 15:03
用的是什么荧光素和Ig类型？

CD3用的是biolegend的APC anti-mouse CD3 Antibody，  Rat IgG2b, κ。 按照他的建议浓度0.5 µg per million cells in 100 µl volume。

其次还有个问题，就是大概多少量的细胞做一次比较合适，就表面marker染色和胞内分别有差别吗？因为我在做的时候，经过各种洗涤，细胞数量我能肉眼看到变少。或者还是因为我离心的问题吗？我是用500g  8min。

谢谢倪老师了

niwanmao

wsjheaven 发表于 2020-11-20 15:16
CD3用的是biolegend的APC anti-mouse CD3 Antibody，  Rat IgG2b, κ。 按照他的建议浓度0.5 µg per mil ...

小鼠细胞小，可能需要增加离心力，否则容易丢失。
细胞量的话，表面和胞内差异不大。你上面说分不开，是胞内染色？

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-20 20:09
小鼠细胞小，可能需要增加离心力，否则容易丢失。
细胞量的话，表面和胞内差异不大。你上面说分不开，是胞 ...

不是，上面说的分不开的是表面marker染色，染的是CD3，用的是biolegend的APC anti-mouse CD3 Antibody，  Rat IgG2b, κ。 按照他的建议浓度0.5 µg per million cells in 100 µl volume。

niwanmao

wsjheaven 发表于 2020-11-22 12:25
不是，上面说的分不开的是表面marker染色，染的是CD3，用的是biolegend的APC anti-mouse CD3 Antibody，  ...

你的实际用量是多少呢？

liuruiluna

FSC/SSC的图最好也发上来看看

wsjheaven

niwanmao 发表于 2020-11-23 09:07
你的实际用量是多少呢？

实际用量也是按这个算的，因为之前有做细胞计数，所以之后按那个比例加的抗体。