我们的实验是用IL2诱导hPBMC细胞，希望检测到下游pstat5的变化，这个实验已经做了好久了，一直都是几乎染不上颜色，尝试了很多条件、很多试剂，都没有太大改善，现在完全没有头绪，不知道该怎么把这个实验做下去了，希望有经验丰富的老师能给我们指点一下方向！不胜感激！！详细的各个细节如下，有任何问题欢迎留言。 1、关于样本：我们目前使用的样本包含hPBMC和一株永生化的肿瘤细胞，都有文献证明其pSTAT5是激活的，并且同样的样本及诱导条件下我们使用ELISA检测到了其正确的磷酸化表达趋势； 2、关于固定：我们使用的是BD的商品化固定试剂，其主要成分是甲醛，是抗体推荐使用的固定试剂； 使用的方法是直接加入与培养基等量的固定液（200ul+200ul），37℃固定10min（该方案为BD试剂说明书提供）； 这一步我们也尝试过使用1%的多聚甲醛室温固定10min，以及BD试剂冰上固定10min，（因为网上有观点认为固定是一个放热反应），但是没有见到明显改善； 3、关于破膜：我们使用的是BD perm Ⅲ破膜试剂，（主要成分是甲醇，高达80%多），1*10^6个细胞我们使用了1ml破膜试剂，冰上破膜30min； 我们也使用过自己实验室配制的0.5%Triton X-100，80%的甲醇试剂，以及bioscience的破膜试剂，结果没有明显区别； 4、关于抗体：我们使用过两种pSTAT5抗体，都是BD的抗体，是文献上报道使用过的克隆号，两种荧光基团,有一株perCP-cy5.5，一个是Alexa Fluor 680； 抗体的浓度的话，我们最高的时候用到过1:5的浓度，也未见染色； 我们的CD3也使用的BD抗体，FITC荧光基团； 5、关于染色：我们是同时染了CD3和pSTAT5两个信号，尝试过先染CD3再破膜再染pSTAT5，也尝试过破膜后同时染CD3和pSTAT5，都是能染上CD3，但是没有pSTAT5信号； 我们稀释抗体和每一步之间的洗涤都是用的PBA缓冲液（2%FBS in PBS）； 6、关于洗涤与重悬：我们洗涤使用的提前预冷的PBA，所有操作都是在冰上完成的，离心条件是4℃ 500~700g 离心5~10min； 重悬我们一般是将液体加入EP管以后，用手弹混悬充分（这里我们曾经怀疑过重悬不充分，所以取了混悬的样本到显微镜下观察，可以看见已经重悬成单个细胞了）；（使用弹匀的方式主要是有说法是抗体吹洗会造成细胞损伤）； 7、关于流式仪器：我们已经使用过两台不同的仪器检测过了，没有太多差别；各项参数都确认过了，电压有点稍微偏高。 8、典型的实验结果如下图：
| 
发表于 2020-11-26 15:36:52
发表于 2020-11-27 20:43:43
