优化和验证流式受体占有率分析的最佳实践

niwanmao

简介
在开发与细胞表面分子结合的基于蛋白质的治疗化合物的过程中，通过受体占用分析(ROA)监测药物与靶点的结合是很重要的。
流式细胞术是用来测量大分子治疗性化合物受体占用（RO）的主要技术，因为它可以测量不同细胞亚群的靶向结合。
虽然ROA在概念上很简单，但它们是最具挑战性的流式细胞术方法之一。
挑战可能与靶标(低水平的抗原表达、稀有群体比例、靶标调节和可溶性靶标的存在)、试剂(用于交叉结合的商业试剂的可用性、内部生产的试剂的开发)以及样品(疾病样本的可用性、样本的稳定性)有关。
在整个药物开发过程中，ROA的应用目的不同。

• 在临床前毒理学研究中，ROA被用来确认异种物种中的靶点参与。考虑到异种物种抗药抗体的流行，这些测量尤其重要(Thway等人，2013年)。
• 当被用作药效学(PD)测量时，ROA数据可以与药代动力学(PK)数据相结合用于建模，以便优化临床试验设计、指导剂量选择，并确定靶向饱和的持续时间和程度(Fisher等人，2016；Quadrini等人，2016；Spilker，Singh，&Vicini，2016；斯特内布林等人，2016；Wyant，Estevam，Yang，&Rosario，2016)。
• 当与抗药物抗体(ADA)结果结合时，ROA数据用于评估ADA对受体结合的影响，并监测长期受体结合与不良事件的关联。
  

ROA测量一般有三种类型：结合受体测量、游离受体测量和总受体测量。这些测量也可用于监测对药物结合的反应中的受体调制(Green等人，2016年；Leung等人，2016年；Stewart等人，2016年)。

• 结合受体是使用荧光标记的抗药单抗对直接与受体结合的药物的评估。当针对受体的抗体不容易获得时，或者当治疗分子本身的直接荧光素结合可能导致结合特性受损时，使用这种方法。
• 游离受体是使用竞争性抗体或荧光标记药物来确定未被药物占据的受体。竞争性抗体直接与药物竞争结合同一表位；因此，使用竞争性抗体检测到的任何受体都将不含药物。同样地，这种带有荧光标记的药物只与那些尚未被药物占据的受体结合，可以用来测量游离受体。
• 总受体测量所有受体，并经常使用针对目标受体的非竞争性抗体。它们将结合到与药物靶向不同的表位，并允许检测所有受体，而不受药物存在与否的影响。或者，可以通过添加过量药物来饱和受体，并使用标记的抗药物抗体来评估饱和的药物结合状态以确定总受体的表达。
  

受体调节评估治疗药物与其靶受体结合对受体总表达的影响。这可能涉及膜结合受体的上调、下调、内化甚至释放。受体调节评估可以通过监测总受体相对于药物治疗剂量和时间的变化来进行。
使用ROA的类型取决于药物的作用机制(MOA)和试剂的可获得性。如果药物的MOA要阻断与目标受体的结合，游离受体分析通常是首选的形式。当由于试剂的可获得性而不能进行游离受体分析时，另一种选择是结合受体分析，即测量药物占据的受体，然后用来从测得的总受体中推算得出游离受体比例。当药物的MOA涉及受体表达的调节，或药物结合后表达受体的细胞会被去除时，总受体分析是有用的(Liang等人，2016)。

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Veblen

老师，我想请问一下流式检测受体占有率是不是需要知道一下几点：

1. 先通过加入过量的经荧光素标记的药物或荧光素标记的non-competitive的抗体，从而获得total receptor的水平（也就是total MFI）；

2. 实际实验过程中总是在一定的药物浓度前提下去计算受体占有率，也就是不同给药浓度条件下，受体占有率的值是不同的？

3. 用直接法计算受体占有率：需要得到荧光标记的抗药抗体MFI，然后用它除以上面的total MFI, 即为RO%;

4. 间接法就是去测与游离受体结合的检测抗体的MFI,再用1-它占total MFI的比例即为RO%. 在这里如果，抗体药物是过量的，是不是RO%等于1？  

5. 对于RO%的计算，一般是抗体药物浓度不饱和，也就是没有完全占据receptor，这样才符合实际情况吧？ 如果饱和了RO%就等于1？  一直在确认这个前提，确实有些不太懂。

希望老师费心一一解答一下，确实不太懂，期待老师对每个问题的回答，万分感谢。

niwanmao

Veblen 发表于 2022-10-23 22:13
老师，我想请问一下流式检测受体占有率是不是需要知道一下几点：

1. 先通过加入过量的经荧光素标记的药物 ...

参见：
抗PD-1抗体药物的受体占用率测量
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-8477-1-1.html
(出处: 流式中文网)