流式细胞术在呼吸系统五大疾病中能做些什么？

niwanmao

呼吸系统疾病是全世界最常见的死亡原因。国际呼吸系统协会论坛(FIRS)将呼吸系统疾病定义为“影响呼吸道和肺部，影响肺活量或体内气体分布”的疾病，五种主要疾病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、急性下呼吸道感染(AILRT)、肺结核和肺癌。

单细胞RNA测序、质谱和流式细胞术等技术对于描述呼吸系统疾病的病理生理机制和寻找诊断标记物至关重要。下面，我们将展示现有的实验证据，证明使用流式细胞术作为监测和诊断呼吸系统疾病的工具的重要性。

## COPD
COPD是全球第三大死亡原因；空气质量差和吸烟是与COPD高度相关的危险因素。

病理生理学上，炎症介质的循环释放促进循环细胞的激活和向肺组织募集。以流式细胞仪为工具，研究表明，COPD患者血液中有高浓度的**IL-33**(丙氨酸氨基转移酶)，易使人体产生针对II型肺泡上皮细胞的自身抗体，因此会对肺组织造成损害。

流式细胞术还可以从COPD患者的肺毛细血管中识别由CD144+(VE-cadherin)、CD31+(PECAM-1)和CD62E+(E-选择素)分子识别的**细胞外囊泡(EV)**，甚至在临床症状出现之前，血浆中就可能出现高水平的EV。这些微囊泡的发现，说明了为COPD患者的随访寻找特定COPD的诊断和监测标记物方面取得了一定的进步。


## 哮喘
哮喘是一种慢性呼吸道炎症性疾病，在其病理生理学中，涉及I型超敏反应过程，在工业化国家，高浓度的悬浮在空气中的颗粒物在机制中起到佐剂的作用，并引发哮喘。

最近发现，哮喘儿童的**嗜碱性粒细胞、单核细胞和浆细胞样树突状细胞的特异性受体IgE-FcεRIα表达增加**。作为临床随访的一部分，Wiest等人发现哮喘患者**淋巴细胞B细胞CD5+、CD1d+CD5+比例降低，而B细胞CD27+比例升高**，提示监测B细胞亚群CD5、CD1d、CD27的表达对哮喘患者的临床随访有一定的参考价值。总而言之，这些结果使得建立临床相关性成为可能，这些相关性可以识别更易患哮喘过敏的人，并在寻找治疗靶点方面开辟了新的选择。

Global Initiative for Asthma(GINA)已经将流式细胞术检测**不变(Vα24Jα18)NKT细胞**作为难治性哮喘(STRA)儿童临床随访的预后因素，该亚群的百分比增加与哮喘的临床并发症相关。通过流式细胞术，发现了细胞毒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的受体改变：C型凝集素(例如NKG2D)受体、维生素D(VDR)受体、IL-4α受体以及IL-18受体。在动物模型中，这些改变与毛细支气管炎的易感性相关[。因此，通过流式细胞术能建立免疫反应细胞的多态变异和细胞亚群的特征，用于哮喘的研究。


## 急性下呼吸道感染
与H1N1、副流感、鼻病毒、B型流感病毒以及新的SARS-CoV-2病毒等病毒引起的呼吸道感染相关的发病率和死亡率，影响着从婴儿到老年人的世界人口的很大比例。Swieboda等人提出了包括14色16个抗体的方案，以通过t-SNE)识别三个固有淋巴细胞亚群、NK细胞、单核细胞、NKT细胞和粒细胞(中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)等，并识别出与急性呼吸道感染期间的特定抗病毒免疫反应相关的变异。
（Swieboda, D., et al. OMIP-062: A 14-color, 16-antibody panel for immunophenotyping human innate lymphoid, myeloid and t cells in small volumes of whole blood and pediatric airway samples. Cytom. Part A 2019, 95, 1231–1235.）

至于流感，有人建议使用基于微球的流式细胞术分析流感病毒的功能表征，而不仅仅通过抗体识别病毒蛋白并区分灭活病毒和流感病毒，还可以进行相对受体亲和力进行功能评估。最近，通过流式细胞术，在既往接种过疫苗的健康成年人中发现了表达IgG1的血凝素特异性记忆B细胞，这一结果提供了评估免疫反应的替代方案，作为加强疫苗接种的反应或作为诊断的补充试验。

研究表明，感染SARS-CoV-2病毒的患者表现出较高的初始T细胞百分比和较低的记忆性T细胞百分比，通过t-SNE评估临床变量和免疫系统细胞的变化，确定了SARS-CoV-2感染患者的三种特征：(1)CD4+T细胞和CD8+T细胞的强烈激活和增殖，以及CD8+T细胞的高度激活和耗竭；(2)CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆B细胞的离散应答；以及(3)淋巴细胞大多未经有效活化。 因此面对SARS-CoV-2感染时效率低下。

另一方面，为了提高目前可用的新冠肺炎抗体检测的敏感性和特异性，Fong等人提出了微球抗体检测(MBA)的方法，认为MBA是一种适用于临床微生物学实验室的简便检测方法，可用于抗SARS-CoV-2抗体的检测。与经典ELISA法比较，该方法对新冠肺炎恢复期患者的特异性为100%，阳性率为89.8%。因此，建议将其作为一种新的SARS-CoV-2感染诊断试验，即使在病毒载量较低的患者中也是如此。

## 结核
结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mtb)引起的传染病。2018年，世界卫生组织(WHO)报告了世界上有近1000万结核病患者，89%的病例发生在15岁以上的男性和女性，11%的病例发生在婴儿。结核分枝杆菌的毒力因子既有蛋白质来源，也有脂质来源。通过流式细胞术，发现单核细胞暴露于来自Mtb细胞壁的糖脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)影响其巨噬细胞的成熟过程，表现为它们降低了Galectin 9、TLR(Toll-like receptor)2和4、CD68、CD33和CD86分子的表达，表明在这些条件下产生的巨噬细胞功能不佳，不能有效地控制Mtb的生长。

最近的研究表明，结核病患者CD8+ TCRαβ+ NKG2Ddim CD56high细胞的比例较高，并且这些细胞具有较强的细胞毒功能。流式细胞术的使用也使得识别非经典细胞群体，如单核细胞和巨噬细胞在分枝杆菌感染时可表达CD3/TcRαβ复合体，这种细胞群在循环和感染部位都会增加,显然，其受到TNF依赖的途径的调节，执行吞噬过程，是促炎细胞因子的重要来源。这一细胞群体的比例可以作为生物标志物对结核病患者进行监测。

最近，Esteves等人通过分析CD154(CD40L)在中央记忆CD4+T淋巴细胞(TCM)中的表达，确定了这个新的潜在标志物，可区分活动性结核病和潜伏性结核病，因为已经观察到这个群体在Mtb激活后扩张，导致了TCM中CD27和CD45RO的表达。在同样的意义上，T细胞中CD161的表达已被观察到作为区分潜伏感染状态的潜在标记物，其敏感性为74%，特异性为86%，足以将其与其他经典的结核病检测结合起来进行诊断。


## 肺癌
只有16%的肺癌患者在疾病的早期被诊断出来，85%的病例是非小细胞型(NSCLC)。肺癌可促进免疫系统的逃避策略，以产生全身水平的免疫抑制环境。流式细胞仪检测PD-1的表达，对于建立阻断PD-1或PD-L1单抗的治疗，从而提高免疫系统对肿瘤细胞的反应和改善患者的生活质量至关重要。近年来，发现具有抗炎功能的细胞群体(如CD4+Treg、CD8+Treg或Breg)、循环中IL-35浓度与肺癌治疗方法的演变相关。

Kotsakis等人观察到非小细胞肺癌患者外周血TregCD4+CD25high细胞中初始亚群、效应亚群和终末亚群比例的差异，说明Treg亚群可能存在预后评估和预测价值，也有可能成为治疗靶点，为患者的临床随访提供了新的选择。（Kotsakis, A., et al. Prognostic value of circulating regulatory T cell subsets in untreated non-small cell lung cancer patients. Sci. Rep. 2016, 6, 39247.）

在相同的背景下，Liu等人发现了CD8+淋巴细胞CD28表达缺失在肺癌进展过程中的重要性。（Liu, C., et al. Prognostic significance of peripheral CD8+CD28+ and CD8+CD28− T cells in advanced non-small cell lung cancer patients treated with chemo(radio)therapy. J. Transl. Med. 2019, 17, 344）。

另外，对白细胞介素(IL)-35信号机制的研究，以及循环细胞获得耐受表型的IL-12p35和IL-27受体的表达，或可代表肺癌进化中的早期窗口，帮助早期和后续诊断用。（Khattak, M.A., et al. PD-L1 expression on circulating tumor cells may be predictive of response to pembrolizumab in advanced melanoma: Results from a pilot study. Oncologist 2020, 25）

下图直观而简要地总结了上述五大类疾病的流式应用实验研究，供大家参考：


文献链接：Flores-Gonzalez, Julio et al. “Flow Cytometry: From Experimental Design to Its Application in the Diagnosis and Monitoring of Respiratory Diseases.” International journal of molecular sciences vol. 21,22 8830. 22 Nov. 2020, doi:10.3390/ijms21228830