【求助】肿瘤组织提取单细胞，流式检测TILs，分群异常

njumedw

各位老师好，学生在论坛潜水已久，今天也发个贴求助一下：本人目前利用美天旎的Tumor Dissociation Kit将临床标本制备单细胞悬液，组织为胃，实验开展1年以来遇到较多问题，还希望与各位前辈讨论交流，为我释疑。下图以近期的一个实验结果为例：
癌旁组织：


肿瘤组织：



染色通道：APC-Cy7 CD45，PE-Cy7 CD3，Percp-Cy5.5 CD8，BV510 CD4
大致过程：肿瘤自离体后，立即取材（黏膜层，多点取材）后浸入无菌HBSS中，带回实验室后PBS清洗两次，遵试剂盒protocol进行组织消化后70目过滤，离心后biosharp裂红液处理5min，再加PBS清洗两次后，4℃避光染色25min，PBS清洗两次后上机检测。结果如图，CD45和CD3尚能做到正常分群，FSC/SSC图也尚可，但CD4/CD8分群始终很不理想，想请教一下各位老师有什么观点？
补充：
1、清洗、染色过程换用过专用的stain buffer，效果不理想；
2、清洗过程损失细胞量很大，且极容易成团，离心后吹打不散，呈黏液团状，各位老师有什么好的方法吗？
3、CD45、CD3流式抗体购自biolegend，CD4、CD8抗体购自BD。
4、以PBMC染色后结果：


PBMC以ficoll法分离，样品取自本人外周血。这一部分CD4mediumCD8+考虑为何种细胞？组织染色中还未见过这种情况。

有实验细节未指出而可能影响实验者，也请各位老师不吝赐教！

niwanmao

从你这个搭配来看，CD4应该没有荧光漏进去，所以如果重复多次均是如此，不排除这个病人本身就有这类细胞。
这类CD4dim、CD8++的细胞，可能还是得考虑特殊情况下（如该患者肿瘤）出现的，TCR接受MHC递呈的能力比较强，这类细胞之前在《T淋巴细胞在CD4/CD8散点图上究竟分为几群？》（
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5199-1-1.html）中讲过。

最后，提醒一下，以后上传图片，在发帖的完整界面中，点击工具栏上的「图片」按钮上传，切勿用BASE64编码嵌入。

njumedw

niwanmao 发表于 2020-12-23 12:24
从你这个搭配来看，CD4应该没有荧光漏进去，所以如果重复多次均是如此，不排除这个病人本身就有这类细胞。
...

主贴里面的是我自己的健康对照，我做病人的外周血样本就没遇到过这种情况。其实外周血有分群都算好的，关键是组织细胞这个没有分群，实在太痛苦了，请问这种情况是消化/裂红导致的表位脱失？还是组织本身浸润细胞少的原因？

njumedw

njumedw 发表于 2020-12-23 13:10
主贴里面的是我自己的健康对照，我做病人的外周血样本就没遇到过这种情况。其实外周血有分群都算好的，关 ...

当然这个PBMC提得是有点差...FS/SS图太丑了

niwanmao

njumedw 发表于 2020-12-23 13:10
主贴里面的是我自己的健康对照，我做病人的外周血样本就没遇到过这种情况。其实外周血有分群都算好的，关 ...

所以说不是你的问题，也不抗体的问题，而是真的病人本身有问题。细胞性质按我前面说的定义。

njumedw

niwanmao 发表于 2020-12-23 20:04
所以说不是你的问题，也不抗体的问题，而是真的病人本身有问题。细胞性质按我前面说的定义。 ...

好的，感谢！