肿瘤组织免疫荧光流式CD3、CD4、CD8分群不明显

stepvenmei3

    RT。LZ最近在做4T1的肿瘤组织免疫荧光流式，分别选用CD45-PE Cy7、CD3-FITC、CD4-APC和CD8-PE为免疫荧光抗体，对样本进行免疫荧光染色。尝试了两次后，发现CD3、CD4、CD8的分群均不明显（尤其是CD4和CD8分群非常不好），仅CD45的分群还行。将CD3、CD4和CD8通道的电压调大很多后，才能或多或少看出一点点的分群。理论上APC和PE都很亮，至少CD4和CD8的分群应该会很好。我脾中提取的淋巴细胞用同样的操作方式，可以获得相当明显的分群。我用的机器是BD Celesta机器，抗体本身的质量问题可以排除（因为脾样本处理后获得的淋巴细胞用同样的抗体染色分群很好）。肿瘤组织我切成小块后，采用胶原酶1、分散酶2、DNA酶1和透明质酸酶四者混合于培养基中，37摄氏度下消化直至无明显组织碎块，随后离心、裂红液重悬裂红、PBS重悬后细胞计数、抗体染色、固定、PBS重悬，第二日上机。请问老师，我这样子的样本处理方式是否有问题？以及，导致CD3、CD4和CD8分群不明显的主要原因会是什么呢？另外，我离心处理样本时采用1800rpm离心5min的条件，但每次发现该条件下离心处理的样本上清液仍有一定浑浊，不知是否是我离心的转速不够或时间不足，导致部分淋巴细胞仍在上清液中被丢弃，进而流式上样时的淋巴细胞样本不足，到时分群不明显？谢谢老师！
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附图1：圈门过程（肿瘤组织样本。最后一幅图：CD4-CD8组合）

圈门过程

附图2：脾样本的分群效果（是否可以证明抗体的质量没问题？左：CD3-CD8组合；右：CD3-CD4组合）
   

niwanmao

组织样本的处理是有技巧的，从这里看，我首先怀疑的是消化过度了。
建议酶解法时间短一点，一般10分钟以内，配合机械法10秒研磨。

stepvenmei3

niwanmao 发表于 2020-12-23 20:02
组织样本的处理是有技巧的，从这里看，我首先怀疑的是消化过度了。
建议酶解法时间短一点，一般10分钟以内 ...

嗯嗯，这次我37度下消化时间达到了5.5h，这么看来确实是时间太久。那，老师您这边提到的“机械法”，能否具体解释一下，是用什么机械，以及如何在10min消化后的基础上处理肿瘤组织的呢？谢谢老师！

一席繁荒

我们这边的机械法是用注射器的活塞，用活塞的橡皮头先在一个100目的筛网上研磨，收集研磨液然后再40目筛网上研磨，收集研磨液。

陈景飞

我觉得你先用剪刀剪碎组织 然后胶原酶消化半小时左右应该是可以的。其次你要确定你的电压都调节好了。如果可以看到你的电压和补偿就可以更进一步的提供建议。

陈景飞

包括你的spleen 感觉明显电压调低了

niwanmao

stepvenmei3 发表于 2020-12-23 20:43
嗯嗯，这次我37度下消化时间达到了5.5h，这么看来确实是时间太久。那，老师您这边提到的“机械法”，能否 ...

4楼和5楼两位站友提到的都是机械法。

另外，如果想更方便呢，可以在顶部的“新奇智造”里面，网购我们研发的魔滤+魔杵套装。

stepvenmei3

陈景飞 发表于 2020-12-24 11:21
包括你的spleen 感觉明显电压调低了

谢谢老师的提醒！我想请问下，您这边提到“ 感觉明显电压调低了”，是否是从数据图中zebra图明显偏扁得出的结论呢？另外，老师您在调电压时，一般都是如何将电压调整在合适范围的呢？就是我感觉经常有时拿BLANK组调电压会偏高或偏低，有人说看Mean值决定，但我感觉我通过观察Mean值用BLANK组调电压时，似乎最后的数据结果控制的也不是那么好（就比如这次的电压就偏低）。因此，想请教下老师，您是否有更好的调电压/补偿的经验呢？谢谢！

stepvenmei3

niwanmao 发表于 2020-12-24 20:25
4楼和5楼两位站友提到的都是机械法。

另外，如果想更方便呢，可以在顶部的“新奇智造”里面，网购我们研 ...

嗯嗯，谢谢老师！我去相关位置看一下产品

stepvenmei3

一席繁荒 发表于 2020-12-24 08:37
我们这边的机械法是用注射器的活塞，用活塞的橡皮头先在一个100目的筛网上研磨，收集研磨液然后再40目筛网 ...

好的，谢谢老师！请问您这边是仅仅用您所述的这些研磨操作即完成了肿瘤组织的单细胞分离，还是研磨操作前也配合了短暂的酶消化操作呢？如果有，是否也是先将肿瘤组织剪刀剪成小碎块，经短时消化后再进行后续研磨操作呢？