脾淋巴细胞刺激实验中，PBS组CD69跟ConA组表达差不多，怎么办

范小亿 · 发表于 2021-1-7 15:53:50

我是通过裂红素提取小鼠脾淋巴细胞的，这边的细胞活率比较低，不知道会不会有影响。刺激的时候用的是终浓度10ug/mL的ConA，还加了CD28/CD49d，培养箱孵育了5小时。孵抗体前也加了CD16/32进行封闭，然后再孵的CD4（FITC）和CD69（AF700）抗体。上机检测的时候发现没加ConA刺激的细胞，CD69表达水平基本是跟加了ConA一样的，我就很纳闷，优化重复了好几次都这样，也不知道是PBS组假阳性还是ConA组根本没刺激起来？求指点

PBS组

ConA组

Mgaxw · 发表于 2021-1-8 10:38:41

激活了的细胞体积和形态都有变化，也就是你第二组淋巴细胞圈门的右边的那一群细胞，你没圈进去肯定看不到CD69的变化

niwanmao · 发表于 2021-1-8 12:52:56

看上去应该是PBS组偏高，是不是PBS内混入了ConA ？或者两管处理时混一起了？

范小亿 · 发表于 2021-1-10 11:20:48

niwanmao 发表于 2021-1-8 12:52
看上去应该是PBS组偏高，是不是PBS内混入了ConA ？或者两管处理时混一起了？ ...

这个没有，我尝试了好几次，都这样。

范小亿 · 发表于 2021-1-10 11:24:24

Mgaxw 发表于 2021-1-8 10:38
激活了的细胞体积和形态都有变化，也就是你第二组淋巴细胞圈门的右边的那一群细胞，你没圈进去肯定看不到CD ...

感谢回复，我尝试了一下你说，圈进去后的变化不大，可能是它本身比例就比较少，可是文献中刺激后的CD69阳性群体应该是很明显的。

范小亿 · 发表于 2021-1-10 11:25:26

niwanmao 发表于 2021-1-8 12:52
看上去应该是PBS组偏高，是不是PBS内混入了ConA ？或者两管处理时混一起了？ ...

老师你好，我现在是在怀疑会不会其实都是阴性，只不过是我电压调的有点大，导致都呈假阳性了。

niwanmao · 发表于 2021-1-10 18:31:03

范小亿发表于 2021-1-10 11:25
老师你好，我现在是在怀疑会不会其实都是阴性，只不过是我电压调的有点大，导致都呈假阳性了。 ...

但是看有比较明显的分群，似乎是真阳。不过你下次用一管不染色的细胞，确定一下电压是否存在过高的可能。

Mgaxw · 发表于 2021-1-11 08:58:48

范小亿发表于 2021-1-10 11:24
感谢回复，我尝试了一下你说，圈进去后的变化不大，可能是它本身比例就比较少，可是文献中刺激后的CD69阳 ...

那你可以试着把时间在12h和24h测一下，我们用1ug和5ug/mL的ConA都能看到很明显的活化，圈门的时候要把右边体积增大的细胞一起圈进去

范小亿 · 发表于 2021-1-11 16:02:15

Mgaxw 发表于 2021-1-11 08:58
那你可以试着把时间在12h和24h测一下，我们用1ug和5ug/mL的ConA都能看到很明显的活化，圈门的时候要把右 ...

好的，我试试看，非常感谢！

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