分享几个染色技巧和样本保存秘招

niwanmao

如果可能，应在活细胞上对表面分子进行染色，以避免预处理步骤（例如细胞固定或细胞破膜）可能引入的任何抗原变性，以清楚地区分细胞内和细胞外定位。

对于同时进行细胞内和表面染色，应先对表面标志物进行染色，然后在对细胞内抗原染色之前先进行固定和破膜。

当细胞确实表达高或低亲和力的Ig Fc受体（例如CD64或CD32）时，应尽可能使用能减少“非特异性”相互作用的重组抗体。

在阻断试剂（例如纯化的Ig）存在下孵育细胞，可以抑制Fc受体介导的免疫球蛋白的非特异性结合。

与血细胞或液体渗出液中的细胞不同，组织中的原代细胞通常需要进行酶解预处理以使组织解离，从而最终获得悬浮的单细胞。但是在此过程中，表面蛋白的抗原性也会受到影响。因此，根据组织类型和感兴趣的细胞，必须仔细确定酶消化的条件。通常，存在多种可用的酶，例如弹性蛋白酶，透明质酸酶，分散酶和不同类型的胶原酶。它们的消化特性不同，因此，就细胞活力、细胞产量和抗原的保存（必须由FCM研究）而言，必须优化孵育时间，温度和酶浓度。
参见：最完整的实体组织酶消化指导手册
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html
(出处: 流式中文网)

对于在组织消化过程中被破坏的非常敏感的抗原，可以将分离的细胞培养过夜，以使受影响的细胞表面蛋白重新表达。原则上，酶促组织消化后获得的细胞比悬浮细胞承受的压力要大得多，因此，分析时需要用死活染料排除死细胞。

尽管理想情况下应使用新鲜样品进行流式细胞仪分析，但目前还是有几种方法可以稳定样本的。
- Ficoll 70 kDa可将血液短期保存长达24小时，其主要目的是抑制由RBC聚集引起的血液沉降诱导的应激。
- 对于长期存储，PBMC的超低温保存是另一种选择。 但应记住，此过程会对某些表面分子（例如CD62L或趋化因子受体）产生负面影响。
- 可用于血液样本长期存储的商品化保存液，例如TransFix、Cyto-Chex BCT、Smart Tube。 后者甚至允许在经过适当处理后分析冷冻血样而不会丢失粒细胞。 但是对于所有这些稳定方案，强烈建议对它们进行彻底的验证以用于感兴趣的表面标记。 这里需要着重提一下我们流式中文网自己研发的「FlowGuard」流式专用保存液，既可明显减轻血样溶血，又对抗原表达强度和FSC保留相当完美，质量不弱于进口，价格仅为进口的1/10，下面是我们在一例临床骨髓样本中的保存对比（左侧列为新鲜样本，中间列为加了FlowGuard®保存液4度保存10天的结果，右侧列为不加保存液4度保存10天的结果）：



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活细胞可能在长时间的体外处理过程中发生死亡，或者可能主动内化表面分子或将其从表面脱落，所以，用抗体标记后，可以通过温和的处理手法来避免这种情况，例如，小心地进行移液、处理时间短、低温（在冰上）或在染色缓冲液中添加叠氮化钠，这会阻止分子的脱落/内在化。 染色后，应立即分析细胞或将其严格保存在冰上和避光。



节选自：Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur. J. Immunol. 2019. 49: 1457–1973

wmj123456

倪老师，这句话能再解释下是什么意思吗？一般避免非特异性结合，使用Fc封闭就可以了，您里面提到的重组抗体是什么意思？
当细胞确实表达高或低亲和力的Ig Fc受体（例如CD64或CD32）时，应尽可能使用能减少“非特异性”相互作用的重组抗体。

niwanmao

wmj123456 发表于 2021-1-23 11:03
倪老师，这句话能再解释下是什么意思吗？一般避免非特异性结合，使用Fc封闭就可以了，您里面提到的重组抗体 ...

重组抗体是利用基因工程做出来的抗体，不是常规用抗原免疫出的，所以批间差非常小，而且在结构设计的时候，就尽量排除了那些非特异性结合的可能性。

Veblen

接上面的问题，我也想请教一下如果目的是要检测CD32 CD64这样的分子，那如何避免抗体Fc端与CD32 CD64的结合？（这应该就是非特异性结合）