贴壁细胞双染（Annexin-V/7-AAD）

sunjunapple · 发表于 2011-5-3 19:29:29

我近期做的一个细胞凋亡实验条件的摸索，
三次做出来的结果都是双染（Annxin-V/7-AAD）空白对照细胞的Annexin-V单阳性(Q4)凋亡率比较高（老板的要求是Q1+Q2+Q4<5%），与自己实验组凋亡率相差不是很多，
所以想问问大家有没有什么小诀窍能够使正常贴壁细胞在染色的过程中Annexin-V单阳性(Q4)凋亡率降低。

niwanmao · 发表于 2011-5-3 19:55:43

sunjunapple 发表于 2011-5-3 19:29

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我近期做的一个细胞凋亡实验条件的摸索，
三次做出来的结果都是双染（Annxin-V/7-AAD）空白对照细胞的Annex ...

我在以前帮研究生检测时，发现贴壁细胞更容易因消化等处理因素而出现PI阳性，而AV阳性反而比较少。
你老板的要求是比较理想的情况下，看来你还是得多重复重复。我个人认为，处理时可以尝试调低胰酶的浓度和减少消化时间，必要时可以与物理方法结合。实验就得多尝试，没办法。

dragonhzqsmmu · 发表于 2011-5-3 23:45:15

之前相关的说明书里面好像是建议不用含EDTA的胰酶消化，这样对细胞损伤小点

stef1981 · 发表于 2011-5-4 10:45:04

Annexin-V单阳性有可能是绿色荧光的干扰，你排除掉了吗？

sunjunapple · 发表于 2011-5-9 12:10:02

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因为细胞相对贴的比较紧，没有像293T细胞那种半贴壁状态，我们也是没有办法。

sunjunapple · 发表于 2011-5-9 12:14:25

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你说的是自发荧光的干扰吗？我选择抗体的时候为了避免这种干扰，选用的是APC标记的Annexin-V。

sunjunapple · 发表于 2011-5-9 12:18:20

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谢谢，因为之前我们实验室没有人做过，现在正在建立这个方法，一般的说明书都是以悬浮细胞作为研究对象，所以接下来的实验我准备用悬浮细胞作为我整个实验的一个对照，看到底是消化之前还是消化之后出了问题，您觉得这可行吗？

niwanmao · 发表于 2011-5-9 13:25:19

sunjunapple 发表于 2011-5-9 12:18

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谢谢，因为之前我们实验室没有人做过，现在正在建立这个方法，一般的说明书都是以悬 ...

贴壁细胞的凋亡我觉得还是选择PI染色测亚G1峰（凋亡峰）的方法更妥当，AV-PI法很难。
可以肯定是消化的原因，没必要做对比的。

ddn111 · 发表于 2011-5-11 10:18:17

依我的经验，通常胰酶消化的话通常不会引起AV单阳性的结果！你可不用胰酶直接用细胞刮把细胞搞下来试试！
如果排除荧光补偿方面的原因外，还有一个可能原因：有的细胞系，本身即使经过温柔的处理也会有大量的凋亡细胞！我以前做个好像是胰岛细胞就是这个样子！AV/PI这种方法并不是万能方法！

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[凋亡检测] 贴壁细胞双染（Annexin-V/7-AAD）