CFSE测细胞增殖结果分析

shunlifasci

各位老师好，我近期做了CFSE检测细胞增殖预实验，但是结果无法分析。想请问下是什么原因
实验方案：新鲜外周血PBMC，加入anti-CD3/cd28各1ug/ml，CFSE终浓度2uM。培养4天。
CFSE单染组：
CFSE染色+刺激剂组

需要请教下，两个图没啥区别觉得。然后每个图上小的峰怎么解释呢。
谢谢

niwanmao

FSC/SSC散点图分群如何？

xiaolong822

分析CFSE荧光强度前，应该要圈定淋巴细胞群，你是不是把碎片圈进去了。

shunlifasci

非常感谢以上老师们的回复。暂时手头没有flowjo，稍后把FSC/SSC散点图附上。
以下是新的结果，我整理了下问题。
1、阴性对照组和实验组比较，横坐标10^3-10^4次方之间都仍存在一个峰，这个峰是怎么回事？（如同我最初问的那样，是我圈门时圈进去的随便？稍后我附上圈门图）
2、我的实验组，0峰（未增殖峰）远高于增殖的峰，解释？增殖的缓慢，或者培养时间还不够？（实际上我的条件是antiCD3/cd28刺激PBMC4天的，我觉得这个时间够了，或许是anti-CD3/cd28仅主要特异性刺激T细胞）
3、实验组和对照组比起来，增殖的峰确实高了一些，但是这个图仍不理想，求建议

samly0

看FSC/SSC散点图分群如何，要先把死细胞和碎片都排除掉，0号峰高说明未发生增殖的细胞数量多，这个可以在收样上机前先在显微镜下看看细胞的增殖状态，数量，大小，折光性，对增殖活力先有个初步的判断，才好分析流式的原因。一般发生增殖后的淋巴细胞体积会变更大，圆，亮，折光性好，活力高时还会有集落。

shunlifasci

samly0 发表于 2021-3-22 09:42
看FSC/SSC散点图分群如何，要先把死细胞和碎片都排除掉，0号峰高说明未发生增殖的细胞数量多，这个可以在收 ...

感谢您的指导。。稍后我确认下我的散点图，但是上机没有染死活，之前染过一次7-AAD，不知道为什么流式图不大对，可能是电压通道没调好。。细胞增殖培养期间和上机前，镜下可以看到克隆团，孔的中心肉眼可以看到白色点状聚集。但具体单个细胞的折光性等我不确定（不会看）。我理解0号峰高——未增殖细胞数量多，考虑我培养时间已达4天，我觉得可能与我用CD3/CD28刺激PBMC有关，或许是刺激剂非特异，要是刺激T细胞或许更好。

samly0

显微镜下可以将视野移到克隆团附近，找单个细胞看，调到最高倍镜下观察单个细胞，跟未刺激组对比，整体是不是都增大了。细胞膜光滑完整的细胞，折光性好亮度会比较高，死细胞胞膜不完整，亮度低

GoodMaoning

samly0 发表于 2021-3-22 09:42
看FSC/SSC散点图分群如何，要先把死细胞和碎片都排除掉，0号峰高说明未发生增殖的细胞数量多，这个可以在收 ...

你好，请问为什么要先排除死细胞呢，死细胞多数是0代细胞，排除死细胞的话增殖比例更高，这样的话数据还准确吗。