培养的人外周血来源的树突状细胞流式问题

CC12345

各位老师帮帮忙，最近培养树突状细胞，来源是人外周血，分PBMC后磁珠分选CD14+培养，按照文献培养，1640培养基加10%血清，加GM-CSF 50ng/ML，IL-4 50ng/ML，三天半量换液补足细胞因子，用的LPS 250ng/ML刺激的成熟，在显微镜下感觉细胞长的很好，流式一检测，CD1a、CD80、CD83、CD86表达都很高，但是CD14表达也很高，图中标记为FITC-CD1a，APC-CY7-CD14，PE-CD80，APC-CD83，Percpcy5.5-CD86，用的对照方法是FMO，这个图是成熟DC，测未成熟DC，CD14表达也很高，想请问这是什么愿意，困扰我很久，是培养的问题还是流式检测的问题，对照没有选好？

CD14

CD1a

CD80

CD86

CD83

niwanmao

做这么多标记，却用直方图来看标记表达，实在是不应该啊。
请用散点图啊。

另外，不知道你说的FMO图分别是怎么样的？

CC12345

niwanmao 发表于 2021-3-17 20:38
做这么多标记，却用直方图来看标记表达，实在是不应该啊。
请用散点图啊。

谢谢倪老师的解答，我看与我做的方向相关的研究很多都是单色荧光标记然后同型对照表示出这些marker的表达量，我想省事用了多色，请问如果多色不应该用直方图，那我要圈出CD14-CD1a阳性再看CD80、86这些的表达量吗？另外，我的FMO对照，其中CD14的对照如图，请问我是对照设置错了吗？

niwanmao

CC12345 发表于 2021-3-18 09:19
谢谢倪老师的解答，我看与我做的方向相关的研究很多都是单色荧光标记然后同型对照表示出这些marker的表达 ...

多色不应该用直方图，除非该直标与其它标记之间补偿调整的非常完美，并且是你研究的单一指标。

我感觉FMO的概念是不是你理解错了，能否描述一下你的FMO是如何设置的？

CC12345

niwanmao 发表于 2021-3-18 11:08
多色不应该用直方图，除非该直标与其它标记之间补偿调整的非常完美，并且是你研究的单一指标。

我感觉FM ...

CD14的FMO我染了其他的CD1a、CD80、83、86，没有染CD14，其他的也都是这样设置的

niwanmao

CC12345 发表于 2021-3-18 11:18
CD14的FMO我染了其他的CD1a、CD80、83、86，没有染CD14，其他的也都是这样设置的 ...

那是对的。
如果你要依次观察这5个指标的表达量变化，得需要设置5管FMO。这样的话，貌似你还不如做单标划算。

能否将你的CD1a/CD80、CD14/CD83、CD80/CD86这几个散点图呈现出来看看？

CC12345

niwanmao 发表于 2021-3-18 13:33
那是对的。
如果你要依次观察这5个指标的表达量变化，得需要设置5管FMO。这样的话，貌似你还不如做单标划 ...

倪老师，主要还因为担心之后加药物，需要设置不同浓度梯度，担心到时候单标的话，DC的量不够，您看看这三张散点图

niwanmao

CC12345 发表于 2021-3-18 19:24
倪老师，主要还因为担心之后加药物，需要设置不同浓度梯度，担心到时候单标的话，DC的量不够，您看看这三 ...

那5管FMO的这三个散点图分别是如何的？
我看CD1a分群明显，其它的分不清，需要参考FMO。

CC12345

niwanmao 发表于 2021-3-18 19:46
那5管FMO的这三个散点图分别是如何的？
我看CD1a分群明显，其它的分不清，需要参考FMO。 ...

老师，这是我1a，80、83、86的FMO散点图，另外， 今天我分选了CD14后，直接将CD14染了这5个抗体，在同一个流式模板中检测，并将FMO、培养的DC还有CD14单核细胞进行了对比（红色是FMO，橙色是CD14单核，蓝色是DC），如图，CD14相对于刚刚分离出来还是表达降低了，其他也都升高了，但是CD14没有降到和别的文献一样（和对照组差不多重合）

niwanmao

CC12345 发表于 2021-3-19 00:26
老师，这是我1a，80、83、86的FMO散点图，另外， 今天我分选了CD14后，直接将CD14染了这5个抗体，在同一 ...

不不不，你还是没理解。我的意思是将你的5管FMO数据，也用7楼帖里面那三个散点图形式呈现。

仅看你这几个图，不太像FMO的图，反而像是空白管。

我想知道的是：
1、你做了几个FMO对照？每个对照加了哪些抗体？
2、你的分析目的仅仅是为了检测CD14的表达率降低？应该是其它标记也要检测表达情况才对啊