磁珠分选CD4+naive（阴选）/CD8+（阳选）后流式上机圈门

shunlifasci

各位老师好，近期实验，新鲜外周血PBMC，用美天旎磁珠CD4+naive（阴选）磁珠和CD8+（阳选）磁珠，有几个问题想请教。
一、我的样本分了两份，分别做的CD4+naive分选（阴性选择）和CD8+分选（阳性选择），我比较了下说明书觉得可以二合一分选，先分选CD8+T细胞（目的细胞在柱子上），流经柱子的悬液再上CD4+阴性选择。想确认一下这样可行嘛？
二、CD4+naive阴选说明书里是用LS，我查了下论坛既往的帖子，也都用LS，如果我的总PBMC量不多，只有1*10^7个，我可以用MS嘛，这样效果是更好还是更差呢？
三、分选后的细胞，我染色了CD45/CD3/CD4/CD8上流式，检测纯度。但是，圈门和纯度的描述我有疑问？我们说CD4或CD8细胞纯度xx%,这个比例是哪个里面的，是占CD45+细胞比例还是CD3+细胞比例呢？
四、结合问题3，请大家指导下我的上机圈门。我的CD4+占CD3+的约80%、CD3+占淋巴细胞约94%。我的CD8+占CD3+约95%、CD3+占淋巴约96%。我的分选结果，CD4纯度有些低，可用嘛？

niwanmao

shunlifasci 发表于 2021-3-28 11:20
老师，我还想问一下，
1、我图中的time门显示的，液流是稳定还是不稳定呢？因为上机过程中有调整速度低俗 ...

1、你这里的液流是好的。
2、你要对比纯度，应该计算CD4+T细胞占所有白细胞的比例。

shunlifasci

还有一个小问题，我发现流式上机时（实验室是BD流式机器）上样速度，低俗、中速、高速不同，可能导致Time门不是一直连续的、略有区别？但其实我比较了Time圈部分（如我上图）与圈全部，对后续结果几无影响。。我下次不想圈time门了，大家觉得呢？

niwanmao

二合一分选的策略理论上可行的，不过我也是理论派，希望站内有实际操作经历的FLOWER参与讨论吧。

第二个我回答不了。

第三个，可以用占CD3的纯度评估效果，纯度是偏低，可能与阴选的策略本身有关。

最后，顺便说一下Time图，还是建议圈，你这里看到的只是液流稳定的时候，高速低速哪个区域都没问题，但是万一哪天液流出了问题，你不去看，就容易出问题。

shunlifasci

niwanmao 发表于 2021-3-25 10:40
二合一分选的策略理论上可行的，不过我也是理论派，希望站内有实际操作经历的FLOWER参与讨论吧。

第二个我 ...

谢谢老师！我的CD4分选确实有问题，应该不可以用于后续实验。Time门可能就像您说的，正常情况下，感觉不出来，要是遇到液流出问题，就有用了。

shunlifasci

niwanmao 发表于 2021-3-25 10:40
二合一分选的策略理论上可行的，不过我也是理论派，希望站内有实际操作经历的FLOWER参与讨论吧。

第二个我 ...

老师，我还想问一下，
1、我图中的time门显示的，液流是稳定还是不稳定呢？因为上机过程中有调整速度低俗到中速，所以time门上有个分界线。但我尝试比较在time门中，全部圈门与部分圈门（我图示是部分圈门：81.7%），对后续结果分析基本没影响。我理解是液流是稳定的，只不过上机调整速度后导致time上有分界线。如果确实如此，那我time门圈门的时候，是应该全部圈呢还是就是像我图中圈门那样？
2、我思考了下，我觉得我的圈门方式对验证磁珠分选纯度是错误的，不应该一级级分下去。因为我就是想看分选后细胞群中某细胞（假设CD4）比例，其实就应该在FSC-A/FSC-H之后进行CD4/SSC圈门，算出来CD4+细胞比例，这才是我想要的“纯度”。您说的“可以用占CD3的纯度评估效果”，即便是占CD3的比例100%，但是CD3可能只占CD45或PBMC的一部分，意味着还是有很多其他杂细胞，我获得的细胞群并不是纯的CD4。 您觉得我的理解对嘛，谢谢老师。