帮看一下，G2M期看不到，可能什么原因？

biored

流式小白，做的不太多。原代前体脂肪细胞，mimic处理48h 后乙醇处理，DAPI染色进行流式细胞周期分析（BD）。如图所示，G2/M期峰看不出来。这块经验并不多，也不知道什么原因，原始数据见附件，大家帮分析下。谢谢！

biored

学生说收细胞时候状态可以，乙醇处理后鲜样进行的染色，做了两次都是这样的结果。负责仪器的老师说是因为换了培养基，最近几个结果都不太好。不过我觉得这个可能影响不大吧？但具体原因也不知道。

tiger

biored 发表于 2021-3-29 17:46
学生说收细胞时候状态可以，乙醇处理后鲜样进行的染色，做了两次都是这样的结果。负责仪器的老师说是因为换 ...

仪器配了紫外吗？

biored

tiger 发表于 2021-3-30 14:37
仪器配了紫外吗？

这个是公共平台共享服务设备，有专门负责老师，仪器设置等方面应该没问题。

niwanmao

biored 发表于 2021-3-29 17:46
学生说收细胞时候状态可以，乙醇处理后鲜样进行的染色，做了两次都是这样的结果。负责仪器的老师说是因为换 ...

看了下数据，个人觉得有两个问题：
1、细胞是否都碎了？
2、我看DAPI设置在P3通道，并且似乎A不如H，是否能确认一下通道是否正确？

wxd

感觉细胞在FSC/SSC坐标中分布不是很好，没有看到明显区别于细胞碎片的主细胞团。原因可能是：1. 消化收取细胞过程造成细胞破损；2. 细胞固定离心过程中由于操作过于剧烈或者离心速度过高造成细胞破损。针对这两点有一下建议：1. 消化过程中加入EDTA（如果细胞允许的话）以提高消化细胞的能力；2. 加入乙醇的前一步，弃上清时不要完全弃干净，留大约20 μL，并震荡离心管使细胞分散，然后逐滴加入预冷75%乙醇；3. 清洗残留乙醇时，离心速度不要超过500g。
另外看细胞在DAPI轴上的分布，有可能DAPI没有染好。不知道原代前体脂肪细胞细胞中脂肪含量怎么样？会不会影响DAPI染色？需不需要固定之外的其他步骤去除脂肪或者延长DAPI的染色时间。
还有，细胞周期想要获取可靠的数据以及好看的结果图片，一般需要收集大约20000-30000个单个细胞。建议在上机时先由FSC/SSC设门，再用FSC-A/H或者FSC-A/W排除黏连细胞，然后再用DAPI-A/H或者DAPI-A/W再排除一次。收集DAPI-A/H或者DAPI-A/W门中细胞30000个。

biored

@niwanmao，wxd，tiger 谢谢大家的建议，按照大家提到的细节再重复一下实验。