小鼠PBMC，Treg/Th17流式求助

Ocean

[img]blob:https://www.flowcyto.cn/2bd4c410-bd32-430b-a813-0fc6979a3b44[/img][img]blob:https://www.flowcyto.cn/7e4f22ae-a90f-4614-afb2-1900a15cbac5[/img]

如图。用APC标记的Foxp3，用PerCP-Cy5.5标记的IL-17A。两张图均先画了CD4阳性门。
左边那张图没有经过Cell stimulation kit刺激，Foxp3的分群很清楚。而右边图片则是为了染IL-17A而将细胞进行刺激，条件是37℃下4小时。Foxp3的分群就差了很多。两个样本除了Cell stimulation kit刺激之外，其他条件完全一致。
我知道用PMA等刺激之后CD4的表达水平会下调，但对于Foxp3来说，效果也是如此吗，还是我的结果存在问题呢？麻烦老师解答，谢谢老师！

Ocean

图片好像挂了，重新上传一下。

niwanmao

Ocean 发表于 2021-3-31 15:08
图片好像挂了，重新上传一下。

不知道是否重复多次均是如此？
刺激之后，往往需要充分将培养基洗涤干净再进行染色，同时，建议有必要加上CD25，利用CD25和foxP3，有时候即使foxP3荧光强度弱一点下来了，也相对容易分群一些。

samly0

Cell stimulation kit里面是什么成分，会不会因为这个试剂是诱导T细胞分化成Th17的，所以Treg就少了？

Ocean

niwanmao 发表于 2021-4-1 08:22
不知道是否重复多次均是如此？
刺激之后，往往需要充分将培养基洗涤干净再进行染色，同时，建议有必要加 ...

是的，重复了很多样本，刺激过的样本很明显Foxp3分群差很多。使用的Cell stimulation kit是eBioscience™ Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X),货号00-4975-93。我们在刺激完以后洗涤了两遍。
我们之前单做Treg的时候是染CD25的，这里因为想做Th17/Treg平衡，参考了几篇高分文献的做法，就没有加CD25了。我想我们之后可以再加染上CD25，谢谢老师的回复~

Ocean

samly0 发表于 2021-4-1 15:04
Cell stimulation kit里面是什么成分，会不会因为这个试剂是诱导T细胞分化成Th17的，所以Treg就少了？ ...

使用的是eBioscience™ Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)，是佛波醇酯 12-十四酸酯 13-乙酸酯 (PMA)、离子霉素、Brefeldin A 和莫能菌素的混合物。

samly0

eBioscience™ Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)这个是为了检测IL-17A这种胞内细胞因子用的，检测Foxp3不需要加。IL-17A是胞内因子，Foxp3是核内因子，我之前标记过Foxp3要用专用的胞核固定破膜剂的，会不会是因为在同一管样本里同时检测胞内和核内因子，影响核内因子的染色？要不分开染试试？

pityham

我做的也是Treg/Th17的平衡，我是分开染的。能加个联系方式交流一下吗。

niwanmao

pityham 发表于 2021-4-14 18:37
我做的也是Treg/Th17的平衡，我是分开染的。能加个联系方式交流一下吗。

这里直接交流不好吗？

pityham

niwanmao 发表于 2021-4-14 19:44
这里直接交流不好吗？

好的，是我的问题可能比较简单，怕大家见笑