请教刺激后PBMC（CFSE标记）应该如何圈门？

shunlifasci

之前问过问题，因当时样本补偿调节不好，近期又重复了几次，结合自己的理解，再次提问。
关于增殖后的PBMC圈门。
     （1）实验方案：anti-CD3/cd28刺激人新鲜外周血分离的、CFSE标记的PBMC，培养5天。
     （2）实验分组：未刺激PBMC培养组、刺激PBMC组、加不同浓度药物的刺激PBMC组
     （3）实验目的：分析药物对T细胞（及亚型：CD4/CD8）增殖影响。
     （4）流式指标：因实验室CD4/死活染料荧光通道冲突，上机时染色了CD45/CD3/CD8抗体（cfse也占用了一个FITC通道）。
比如这张图，刺激后的PBMC，我应该如何圈门呢？
圈门1（方框/比例13.4）应该都是增殖的细胞，因为下一级图的CFSE结果是全增殖，明显手指峰。圈门3（不规则/比例2.99）应该都是未增殖的细胞，理由也是结合下一级图CFSE结果。
    但考虑我的刺激剂是TCR特异性，理论上刺激PBMC里的T细胞，通常情况下PBMC（FSC/SSC图）中的圈门3应该是淋巴细胞群体（T+B），结合我想研究的也是药物对T细胞增殖能力影响。我觉得应该是以2为圈门（比例17.7），更合适。
我不确定，想听大家指导？还有个问题，刺激剂是不是理论上让T细胞全部都能增殖呢，我感觉似乎有的CD3+群体也没有增殖？
（上传部分原始数据，请老师赐教，谢谢）

shunlifasci

我实验室没有做过刺激后PBMC圈门经验，所以不确定此图（FSC/SSC）圈门。但是，如果这一级别圈门不好，显然对后续CFSE增殖结果影响会很大。要是全选增殖的细胞群，后续CFSE结果>90%增殖。要是加上部分未增殖淋巴细胞，后续CFSE结果会下降不少。

niwanmao

这个图的横坐标是FSC？如果是的话，我个人倾向于2

shunlifasci

niwanmao 发表于 2021-4-12 16:09
这个图的横坐标是FSC？如果是的话，我个人倾向于2

是FSC的图，倪老师