流式抗体染色抗体竞争现象探索

saillove

    最近在做流式实验时候，发现我染色时两种不同蛋白抗体似乎存在竞争关系，两种蛋白目前无直接关系。在收集细胞后，如若将A抗体（PC5.5）和B抗体（BV605）同时加入与细胞孵育45分钟，流式上机时A抗体阳性率90%，B抗体0%。而单染A抗体时A抗体阳性率90%，单染B抗体时B抗体阳性率20%。因此我思考两种抗体可能存在竞争关系，我进一步先染B抗体45分钟，洗掉之后染A抗体45分钟，上机则显示A抗体阳性率90%，B抗体阳性率20%。
    此时我考虑是否这两个蛋白结构相似，或者两个激光通道有影响，因此我更换B抗体颜色为PE，克隆号不变，仍存在一样情况。
    进一步我更换A抗体克隆号和配色，此时染色正常，即同时染色时A抗体阳性率90%，B抗体阳性率20%。
    不知道大家是否遇到过这种情况？是否A蛋白和B蛋白结构上有相似区域？流式抗体均为单克隆抗体，购自Biolegend。

niwanmao

是存在的，这也是多色流式时，我们大家都需要关注的，不是所有的抗体都可以搭配在一起。

一席繁荒

niwanmao 发表于 2021-4-20 08:00
是存在的，这也是多色流式时，我们大家都需要关注的，不是所有的抗体都可以搭配在一起。 ...

倪老师您好，我是用的APC和APC/Cy7这两种颜色的抗体，是不是也会存在楼主所描述的这种现象，我这边用的流式细胞仪是BD FACS CantoII这台机器。

荷兰西瓜

niwanmao 发表于 2021-4-20 08:00
是存在的，这也是多色流式时，我们大家都需要关注的，不是所有的抗体都可以搭配在一起。 ...

倪老师，那这种情况有什么比较好的解决办法吗？我做实验也经常遇到类似的问题，即同一个抗体在不同的染色方案里的阳性率水平完全不一样，统计的时候也不确定应该以哪个数据为准

niwanmao

一席繁荒 发表于 2021-4-20 08:44
倪老师您好，我是用的APC和APC/Cy7这两种颜色的抗体，是不是也会存在楼主所描述的这种现象，我这边用的流 ...

荧光素的光谱重叠，主要是造成荧光渗漏，可通过荧光补偿调节解决。
但是楼主这个现象，是比较少见的相互结合干扰，具体原因我也无法给出明确的答复，但无论是临床还是科研的多色流式上，都有可能碰到，所以一般建议大家尽可能采用一些权威文献上的方案组合，如果自己组合的话，尽量根据一些细胞表达特征进行推断是否存在干扰。

niwanmao

荷兰西瓜 发表于 2021-4-20 10:29
倪老师，那这种情况有什么比较好的解决办法吗？我做实验也经常遇到类似的问题，即同一个抗体在不同的染色 ...

如我前面回答的那样，没有非常好的解决方案。
但是这种现象非常少见，所以不需要当成常见现象那样紧张。
如果你遇到不同染色方案里面阳性率不同，首先还是建议先排除荧光补偿的原因，其次，要从抗体滴度上找原因。

一席繁荒

niwanmao 发表于 2021-4-20 14:14
荧光素的光谱重叠，主要是造成荧光渗漏，可通过荧光补偿调节解决。
但是楼主这个现象，是比较少见的相互 ...

好的，谢谢倪老师解惑。