小心，APC染料在特殊情况下也有可能出现非特异性染色

niwanmao

流式细胞术免疫表型（FCI）在白血病和淋巴瘤的诊断和表征中起着重要作用，其中慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）最常见。 CLL/SLL的诊断大多数情况下是简单的，B细胞呈CD5+、CD23+、CD200+和FMC7-的免疫表型特征，而表面免疫球蛋白（sIg）和CD20的表达则微弱或缺失（Ginaldi等，1998； Mautes＆Polliack，2000； Moreau等，1997），当然，也存在没这么典型表型的病例。

随着单克隆抗体疗法的日益发展，确定每种流式抗体是否表达以及表达水平，其准确性非常重要。2021年4月30日的Cytometry B杂志上，Wesley Smith等人介绍了一例CLL/SLL，是一位77岁的非裔美国女性，有12年的CLL/SLL病史，没有接受治疗，有持续性贫血和淋巴结肿大9个月。该病例表型很典型，但是肿瘤性B细胞对APC荧光染料非特异性粘附很明显。

方案如下，作者用了4色方案，所以可排除荧光渗漏引起的非特异性染色：



CD3和CD8APC非特异性染色结果如下图：




这里描述的现象具有临床和技术意义，特别是单管使用的抗体越来越多时，抗原、抗体和荧光染料之间的相互作用变得越来越复杂，并且发现技术性异常的机会也越来越难。 此外，随着靶向疗法的发展，准确性至关重要。 尽管荧光染料的交叉反应性已报道与串联染料有关（Hulspas等，2009），但APC不是串联染料。以前虽然已有作者报道了APC在荧光显微镜下的交叉反应性（Kuddus＆Ramteke，2009），但是临床流式细胞术中发现类似现象还是首次报道。

在评估这种现象时，作者最初考虑是不是交叉反应引起。但是，没有发现相关性，因为在相隔数月的多次采样中均能检测到同样的异常染色，而在其他患者样本均未出现相似的交叉反应，并且制造商也没有报道这些抗体存在交叉反应。

接着，作者又在想，是不是抗体的结构变异引起，但APC和其他荧光染料具有各种不同亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b），后来又测试了其他荧光染料结合的抗体，证实了仅与APC标记的抗体结合，而且仅在肿瘤性淋巴细胞上有此类非特异性结合，其余的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞均显示正常抗原表达模式，且与荧光染料偶联物无关，阴性内对照的背景没问题。

最后，作者另外注意到APC标记的同型对照也会与肿瘤细胞结合，但不与其他细胞结合，从而确认了这个现象就是由APC荧光素引起。

要考虑的另一个因素是制造商将抗体与荧光染料偶联的方法。据推测，方案中的所有BD抗体都以相同的方式偶联，但 我们无法评价荧光素结合方法是否影响。

最后，患者本身的特殊性可能是这一独特事件的根本基础，因为这个亲APC克隆是在她第二次使用苯达莫司汀治疗后发生自身免疫性（AI）中性粒细胞减少症时出现的，这表明这可能是通过半抗原现象、免疫复合物形成或表位改变而导致的。 另外发生的时间点也是在该患者发生了κ轻链限制的淀粉样变性之后，据报道只有0.02％的CLL/SLL患者（Kourelis等人，2013）会发生，故也可能APC荧光染料与该病存在交叉反应有关。

聊到这里，我觉得有必要提醒大家，一旦遇到不合理的现象，务必学习作者那样，通过上述思路，逐一排查，最后确定其真实性。

参考文献：Smith, Wesley et al. CLL/SLL specifically binding to the APC fluorochrome: A previously undescribed phenomenon. Cytometry. Part B, Clinical cytometry, 10.1002/cyto.b.22006. 30 Apr. 2021, doi:10.1002/cyto.b.22006