细胞阳性变化问题

半年y

各位老师同学大家好！近期做实验出现一些问题，在此提出来交流一下!
最近做实验发现某些样本在上机检测时，具体为检测的CD19分子，第一次上机大约只有30%的阳性率，样品来源为脾脏，正常来说CD19比例应该不会这么低。此时向该样品中加入一些PBS重新涡旋后（样品中本就有用来重悬细胞的PBS），CD19的阳性率可提高10%左右。不知道这是为何？中间可能相差不超过五分钟。因为我们是在2ml的EP管里制作，每次弃去上清后就加入抗体，因此第一次发现后，考虑可能是染色时染色体系不够大，因为可能反应不够充分（染色条件为4°30min，理论上应该是够的）。今天在实验中专门在加入抗体染色前用100ulPBS重选了细胞再加的抗体，上机发现还是阳性率低，因此又加了点PBS，发现还是像上次一样，阳性率提高不少。这到底是为什么？我知道上样速率可能会导致CV变大，阳性率有差异，但不可能差这么大吧？
同时，这组细胞仅仅进行了表染，我还有其他组也染了CD19，但是进行了破核固定，同样一只鼠的样本，CD19的阳性率就很高，实在是想不明白，因此问问各位FLOWer，希望能够得到解答！谢谢大家

半年y

加入抗体后也充分涡旋了细胞

闷油瓶

你试试下次直接连续测两次，一点PBS都不加，估计阳性率也会提高

半年y

闷油瓶 发表于 2021-5-11 19:59
你试试下次直接连续测两次，一点PBS都不加，估计阳性率也会提高

那属于可控的误差  不会差的这么多

niwanmao

如有可能，把图（包括阴性对照和样本）放上来。
我估计你这个是单峰分布，所以你的分析门放置位置偏左偏右就变化很大，导致你这里所谓的相差10％。