培养后的细胞流式圈门分析

shunlifasci

各位老师好，我近期体外培养了human-PBMC、B细胞、CD8+T细胞，其中B和CD8均是磁珠分选后，加入特异性刺激剂（比如anti-cd3/cd28等）培养。培养后的细胞上流式，发现CD45及下游CD19或者CD8总是分为明显的两群，这让我圈门有些犹豫和困惑。以下以培养后的B细胞上机检测为例。
经过讨论，我个人理解，分的两群，右侧群是确定的CD45或者CD19，左侧群是培养后“要死不死”或者就是死细胞，理由是FSC/SSC图形上左侧群接近细胞碎片的位置。最终圈门，我会只圈最右侧的门。
解决方案：后续加染死活。但是因为死活染料占据荧光通道，只是想尝试一下，后续仍考虑继续“经验”画图。
请老师们指正。谢谢

shunlifasci

我实验室对于培养后的细胞圈门方式经验较少，请各位老师不吝赐教！我理解的圈门方式是否正确？谢谢

niwanmao

shunlifasci 发表于 2021-5-17 10:04
我实验室对于培养后的细胞圈门方式经验较少，请各位老师不吝赐教！我理解的圈门方式是否正确？谢谢 ...

培养前、刚分出来时，是怎么样的？

shunlifasci

附图，分选前后细胞图。用分选后的细胞继续培养。

shunlifasci

niwanmao 发表于 2021-5-17 14:54
培养前、刚分出来时，是怎么样的？

已上传，请倪老师指导，谢谢！

shunlifasci

咨询了身边的人，还是建议染死活看看吧。
但是，我不是很看好染色死活，因为如果细胞“要死不死”，死活染料不一定分得开，对吧？
另外，通过比较分选后即培养前的细胞与培养后的细胞，培养前的CD19细胞主群在10的4次方右侧，培养后的CD19分两群分别在10的4次方左侧和右侧，所以我倾向于圈右侧的细胞群体，这是否又是支持我圈门的依据呢？

niwanmao

shunlifasci 发表于 2021-5-18 11:23
咨询了身边的人，还是建议染死活看看吧。
但是，我不是很看好染色死活，因为如果细胞“要死不死”，死活染 ...

培养后，死活还是得染，有时候分得不是很开，但是还是能看出群体差异的。

不过，我个人感觉，你分出来的细胞还是相对比较纯的，而培养刺激后，是不是因为B细胞分化的缘故，导致CD19部分出现下调（因为浆细胞的CD19是弱于B细胞的）

shunlifasci

更新：上次讨论后，得到建议培养的细胞上机前染死活，以及B细胞可能在刺激剂的作用下分化成浆细胞。
因此，更新实验方案，加染死活染料，做了不加刺激剂和加刺激剂两个组。
结果如图，说实话，我觉得仍然无法解释为何B细胞分两群呢？

shunlifasci

niwanmao 发表于 2021-5-18 16:57
培养后，死活还是得染，有时候分得不是很开，但是还是能看出群体差异的。

不过，我个人感觉，你分出来的 ...

倪老师，已更新实验方案，但似乎仍无法解释为何分选后的B细胞培养48h后上机分两群？我觉得不能是抗体的原因，理由是分选前上机CD19阴阳群明显，且培养后上机CD45既已分两群。

niwanmao

shunlifasci 发表于 2021-6-2 22:09
倪老师，已更新实验方案，但似乎仍无法解释为何分选后的B细胞培养48h后上机分两群？我觉得不能是抗体的原 ...

不加刺激剂那组，也是经过培养的，是吧？