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[标本处理] 培养后的细胞流式圈门分析

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发表于 2021-5-17 10:01:30 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏2流星未解决
各位老师好,我近期体外培养了human-PBMC、B细胞、CD8+T细胞,其中B和CD8均是磁珠分选后,加入特异性刺激剂(比如anti-cd3/cd28等)培养。培养后的细胞上流式,发现CD45及下游CD19或者CD8总是分为明显的两群,这让我圈门有些犹豫和困惑。以下以培养后的B细胞上机检测为例。
经过讨论,我个人理解,分的两群,右侧群是确定的CD45或者CD19,左侧群是培养后“要死不死”或者就是死细胞,理由是FSC/SSC图形上左侧群接近细胞碎片的位置。最终圈门,我会只圈最右侧的门。
解决方案:后续加染死活。但是因为死活染料占据荧光通道,只是想尝试一下,后续仍考虑继续“经验”画图。
请老师们指正。谢谢




培养后细胞分两群

培养后细胞分两群

只圈左侧群

只圈左侧群

只圈右侧群,我认可的圈门方式

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 楼主| 发表于 2021-5-17 10:04:13 | 显示全部楼层
我实验室对于培养后的细胞圈门方式经验较少,请各位老师不吝赐教!我理解的圈门方式是否正确?谢谢
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发表于 2021-5-17 14:54:42 | 显示全部楼层
shunlifasci 发表于 2021-5-17 10:04
我实验室对于培养后的细胞圈门方式经验较少,请各位老师不吝赐教!我理解的圈门方式是否正确?谢谢 ...

培养前、刚分出来时,是怎么样的?
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 楼主| 发表于 2021-5-17 16:13:13 | 显示全部楼层
附图,分选前后细胞图。用分选后的细胞继续培养。

分选前及分选后

分选前及分选后
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 楼主| 发表于 2021-5-17 16:14:08 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-5-17 14:54
培养前、刚分出来时,是怎么样的?

已上传,请倪老师指导,谢谢!
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 楼主| 发表于 2021-5-18 11:23:31 | 显示全部楼层
咨询了身边的人,还是建议染死活看看吧。
但是,我不是很看好染色死活,因为如果细胞“要死不死”,死活染料不一定分得开,对吧?
另外,通过比较分选后即培养前的细胞与培养后的细胞,培养前的CD19细胞主群在10的4次方右侧,培养后的CD19分两群分别在10的4次方左侧和右侧,所以我倾向于圈右侧的细胞群体,这是否又是支持我圈门的依据呢?
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发表于 2021-5-18 16:57:20 | 显示全部楼层
shunlifasci 发表于 2021-5-18 11:23
咨询了身边的人,还是建议染死活看看吧。
但是,我不是很看好染色死活,因为如果细胞“要死不死”,死活染 ...

培养后,死活还是得染,有时候分得不是很开,但是还是能看出群体差异的。

不过,我个人感觉,你分出来的细胞还是相对比较纯的,而培养刺激后,是不是因为B细胞分化的缘故,导致CD19部分出现下调(因为浆细胞的CD19是弱于B细胞的)
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 楼主| 发表于 2021-6-2 22:06:50 | 显示全部楼层
更新:上次讨论后,得到建议培养的细胞上机前染死活,以及B细胞可能在刺激剂的作用下分化成浆细胞。
因此,更新实验方案,加染死活染料,做了不加刺激剂和加刺激剂两个组。
结果如图,说实话,我觉得仍然无法解释为何B细胞分两群呢?

加染死活,加或不加刺激剂

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 楼主| 发表于 2021-6-2 22:09:05 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-5-18 16:57
培养后,死活还是得染,有时候分得不是很开,但是还是能看出群体差异的。

不过,我个人感觉,你分出来的 ...

倪老师,已更新实验方案,但似乎仍无法解释为何分选后的B细胞培养48h后上机分两群?我觉得不能是抗体的原因,理由是分选前上机CD19阴阳群明显,且培养后上机CD45既已分两群。
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发表于 2021-6-3 12:33:32 | 显示全部楼层
shunlifasci 发表于 2021-6-2 22:09
倪老师,已更新实验方案,但似乎仍无法解释为何分选后的B细胞培养48h后上机分两群?我觉得不能是抗体的原 ...

不加刺激剂那组,也是经过培养的,是吧?
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