balb/c小鼠淋巴细胞Treg，用foxp3标记，固定破膜之后细胞几乎没有了.

鲁晶晶

balb/c小鼠从全血和脾脏提取淋巴细胞Treg，用 CD4、CD25、foxp3标记，固定破膜之后细胞沉淀几乎没有了.而且上机细胞群体分群也发生了变化，用的Biolegend的固定破膜产品，是什么问题呢

刘野

我也在做这个，我也同样发现固定之后细胞量明显变少，并且荧光抗体也并没有标记上。

niwanmao

foxP3的话，可以改用文献引用次数更多的ebio的破膜剂。不过呢，还是跟操作细节有关，例如离心速度、离心后去上清的手法。

飞翔

用过ebio和BD的固定破膜剂进行检测，没有问题

鲁晶晶

飞翔 发表于 2021-6-28 21:14
用过ebio和BD的固定破膜剂进行检测，没有问题

我是按照说明书里步骤来的，
  1、加入1mL1*固定液重悬混匀细胞，震荡混匀3s，室温避光孵育60min;
2. 继续加入2ml 1*破膜buffer，350g离心5min,弃上清。共2次。
3. 100ul 1*破膜buffer重悬细胞，加入2 ul PE-FoxP3抗体，室温避光孵育30min;
4. 加入2ml 1*破膜buffer，350g离心5min,弃上清;
5. 加入500 uL PBS洗涤，350 g 离心5 min, 弃上清;。
6. 300 uL PBS重悬细胞，上机检测。（保存、运输过程要避光）。
还有离心的转速不能太大是吗，但是我发现有时候350g的速度不太能把细胞沉淀下来，就提高到了400g，是可行的吗？
还有做过成功的老师能不能给我看一下您的步骤，还有做出来的染的Treg的图呢，我固定破膜完以后和其他管的细胞分群都不一样了

鲁晶晶

刘野 发表于 2021-6-28 18:49
我也在做这个，我也同样发现固定之后细胞量明显变少，并且荧光抗体也并没有标记上。 ...

那老师您最后是怎么解决得呢

鲁晶晶

刘野 发表于 2021-6-28 18:49
我也在做这个，我也同样发现固定之后细胞量明显变少，并且荧光抗体也并没有标记上。 ...

那老师您最后是怎么解决的呢，您上机的时候经过固定破膜的细胞群体分布和其他管相同吗

飞翔

鲁晶晶 发表于 2021-6-28 22:46
我是按照说明书里步骤来的，
  1、加入1mL1*固定液重悬混匀细胞，震荡混匀3s，室温避光孵育60min;
2. 继 ...

按说明书来就行，也可能用的抗体和固定破膜组合不适用。

固定破膜与未进行固定的，FSC和SSC差别很大的

zjcxchentian

我们老师说做FOXP3破核之后细胞的大小就是会发生变化的，会变小，然后沉淀确实也会变少，细胞量比较少的情况下甚至会看不到沉淀，我做人的也是这样，如果细胞量比较多破核之后就还有沉淀，细胞量比较少的时候常常看不见沉淀，洗的过程中可能确实存在细胞丢失，但并不影响上机，细胞还是存在的，只要FOXP3是染出来的应该问题不大吧，破核剂eb和biolegend我都用过，没有大问题

鲁晶晶

但是细胞分群也会改变，那这个时候我要怎么来圈我的目的细胞群呢