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[标本处理] balb/c小鼠淋巴细胞Treg,用foxp3标记,固定破膜之后细胞几乎没有了.

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发表于 2021-6-28 16:28:13 来自手机 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
balb/c小鼠从全血和脾脏提取淋巴细胞Treg,用 CD4、CD25、foxp3标记,固定破膜之后细胞沉淀几乎没有了.而且上机细胞群体分群也发生了变化,用的Biolegend的固定破膜产品,是什么问题呢

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发表于 2021-6-28 18:49:04 | 显示全部楼层
我也在做这个,我也同样发现固定之后细胞量明显变少,并且荧光抗体也并没有标记上。
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发表于 2021-6-28 20:39:55 | 显示全部楼层
foxP3的话,可以改用文献引用次数更多的ebio的破膜剂。不过呢,还是跟操作细节有关,例如离心速度、离心后去上清的手法。
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发表于 2021-6-28 21:14:24 | 显示全部楼层
用过ebio和BD的固定破膜剂进行检测,没有问题
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 楼主| 发表于 2021-6-28 22:46:23 来自手机 | 显示全部楼层
飞翔 发表于 2021-6-28 21:14
用过ebio和BD的固定破膜剂进行检测,没有问题

我是按照说明书里步骤来的,
  1、加入1mL1*固定液重悬混匀细胞,震荡混匀3s,室温避光孵育60min;
2. 继续加入2ml 1*破膜buffer,350g离心5min,弃上清。共2次。
3. 100ul 1*破膜buffer重悬细胞,加入2 ul PE-FoxP3抗体,室温避光孵育30min;
4. 加入2ml 1*破膜buffer,350g离心5min,弃上清;
5. 加入500 uL PBS洗涤,350 g 离心5 min, 弃上清;。
6. 300 uL PBS重悬细胞,上机检测。(保存、运输过程要避光)。
还有离心的转速不能太大是吗,但是我发现有时候350g的速度不太能把细胞沉淀下来,就提高到了400g,是可行的吗?
还有做过成功的老师能不能给我看一下您的步骤,还有做出来的染的Treg的图呢,我固定破膜完以后和其他管的细胞分群都不一样了
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 楼主| 发表于 2021-6-28 22:47:16 来自手机 | 显示全部楼层
刘野 发表于 2021-6-28 18:49
我也在做这个,我也同样发现固定之后细胞量明显变少,并且荧光抗体也并没有标记上。 ...

那老师您最后是怎么解决得呢
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 楼主| 发表于 2021-6-28 22:48:24 来自手机 | 显示全部楼层
本帖最后由 鲁晶晶 于 2021-6-29 06:30 编辑
刘野 发表于 2021-6-28 18:49
我也在做这个,我也同样发现固定之后细胞量明显变少,并且荧光抗体也并没有标记上。 ...


那老师您最后是怎么解决的呢,您上机的时候经过固定破膜的细胞群体分布和其他管相同吗
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发表于 2021-6-29 13:29:07 | 显示全部楼层
鲁晶晶 发表于 2021-6-28 22:46
我是按照说明书里步骤来的,
  1、加入1mL1*固定液重悬混匀细胞,震荡混匀3s,室温避光孵育60min;
2. 继 ...

按说明书来就行,也可能用的抗体和固定破膜组合不适用。

固定破膜与未进行固定的,FSC和SSC差别很大的
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发表于 2021-8-26 18:24:23 | 显示全部楼层
我们老师说做FOXP3破核之后细胞的大小就是会发生变化的,会变小,然后沉淀确实也会变少,细胞量比较少的情况下甚至会看不到沉淀,我做人的也是这样,如果细胞量比较多破核之后就还有沉淀,细胞量比较少的时候常常看不见沉淀,洗的过程中可能确实存在细胞丢失,但并不影响上机,细胞还是存在的,只要FOXP3是染出来的应该问题不大吧,破核剂eb和biolegend我都用过,没有大问题
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 楼主| 发表于 2021-9-18 10:23:08 来自手机 | 显示全部楼层
但是细胞分群也会改变,那这个时候我要怎么来圈我的目的细胞群呢
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