胞内细胞因子检测（PBMC抗凝剂选择）

Eugene

请问下做过胞内因子染色的大佬们，我做的四种胞内因子，IFN-γ、IL-2、TNF-α和CD107a，用的EDTA抗凝的冻存PBMC，阳性对照是PMA/Ionomycin刺激，实验组用的抗原肽库刺激，之前做的标本IFN-γ和CD107a表达都挺好，IL-2和TNF-α表达很弱，本来以为是IL-2和TNF-α本身表达就弱，最近看到说胞内因子染色不能用EDTA抗凝血，否则IFN-γ和TNF-α等会不表达，但为啥我的IFN-γ又是表达的？于是我又去做了下肝素和EDTA抗凝血的比较，只做了一个标本，发现两种抗凝血IL-2和TNF-α表达都很弱。
想问下EDTA抗凝血真的会有影响吗？网上搜的有的说最好用肝素抗凝，次之用EDTA抗凝；有的说可以用EDTA抗凝血，提取PBMC后多洗两遍就行。
还有个问题是，EDTA影响的原因是螯合了钙离子，影响需要钙离子的刺激通路，那抗原肽库刺激是需要钙离子的吗？
求大佬们一个肯定的回答，救救孩子吧，万分感谢！

niwanmao

这篇聚会的技术PPT，可以解答你很多疑问：
第20次线下聚会PPT：人、小鼠、大鼠Th1/Th2/Th17条件优化
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-8047-1-1.html
(出处: 流式中文网)

Eugene

niwanmao 发表于 2021-7-7 10:17
这篇聚会的技术PPT，可以解答你很多疑问：
第20次线下聚会PPT：人、小鼠、大鼠Th1/Th2/Th17条件优化
https: ...

倪老师，您发的PPT内容我看完了，这个意思是通过淋巴分离液提取后可以用EDTA抗凝血是吗？但里面有张IL17A表达的PPT（截图）显示的EDTA抗凝血中表达的明显低于肝素钠/锂呢

niwanmao

Eugene 发表于 2021-7-7 14:32
倪老师，您发的PPT内容我看完了，这个意思是通过淋巴分离液提取后可以用EDTA抗凝血是吗？但里面有张IL17A ...

看来你看完了等于没看呀

这个图意思是，你在采集血液样本的时候，用肝素锂是最好的选择，染出的胞内因子比例、分群最好。

Eugene

niwanmao 发表于 2021-7-8 07:45
看来你看完了等于没看呀

这个图意思是，你在采集血液样本的时候，用肝素锂是最好的选择，染出的胞内 ...

倪老师，恕我愚钝   还想问下老师：
这张图里能看出肝素锂抗凝效果是最好的，肝素抗凝的IL17A阳性细胞大于3%，而EDTA抗凝的阳性细胞只有0.6%，差的有点多，那EDTA抗凝血做出的结果能反映真实情况吗？能用EDTA抗凝血做吗？

niwanmao

Eugene 发表于 2021-7-9 09:28
倪老师，恕我愚钝   还想问下老师：
这张图里能看出肝素锂抗凝效果是最好的，肝素抗凝的IL17A阳性细胞 ...

无论是分群，还是比例，都明显说明了，EDTA不适合。

Eugene

niwanmao 发表于 2021-7-9 09:53
无论是分群，还是比例，都明显说明了，EDTA不适合。

好吧，那下面这张图只是表示能刺激出细胞因子，但表达的比例不一定正确是吗


还有想问下倪老师，抗原肽库刺激的话，好像不依赖钙离子，那可以用EDTA抗凝血吗？特别感谢老师！

niwanmao

Eugene 发表于 2021-7-9 19:15
好吧，那下面这张图只是表示能刺激出细胞因子，但表达的比例不一定正确是吗

我觉得上面的文字写得很清楚了，不知道你为什么会理解成这个意思？

首选肝素锂。
其次，如果不小心用了其它抗凝剂，尽量通过ficoll提出细胞，再刺激。

这样是否能明白？

Eugene

谢谢倪老师，我是之前用Ficoll提取后冻存的PBMC，用的都是EDTA抗凝血，现在准备批量做流式，已经做了小部分了，现在发现这个问题，纠结要不要做下去，用EDTA抗凝血得到的结果靠谱吗，可以发表的吗？求倪老师指点

niwanmao

Eugene 发表于 2021-7-13 18:46
谢谢倪老师，我是之前用Ficoll提取后冻存的PBMC，用的都是EDTA抗凝血，现在准备批量做流式，已经做了小部分 ...

唉，你还是没理解，只要Ficoll提取，就去除了EDTA的影响，就可以用。